Summary

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

Published: August 25, 2018
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Summary

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Abstract

El pollo embrionario se utiliza comúnmente como un organismo modelo confiable para el desarrollo de vertebrados. Su accesibilidad e incubación corto período es ideal para la experimentación. En la actualidad, el estudio de estas vías de desarrollo en el embrión de pollo se lleva a cabo mediante la aplicación de inhibidores y las drogas en los sitios localizados y a bajas concentraciones usando una variedad de métodos. In vitro cultivo de tejidos es una técnica que permite el estudio de los tejidos separados del organismo anfitrión, mientras que al mismo tiempo pasando por alto muchas de las limitaciones físicas presentes al trabajar con embriones enteros, como la susceptibilidad de los embriones a altas dosis de químicos potencialmente letales. Aquí, presentamos un organotypic cultivo de protocolo para el cultivo del embrionario pollo media cabeza en vitro, que presenta nuevas oportunidades para el examen de los procesos de desarrollo más allá de los métodos actualmente establecidos.

Introduction

El embrionario pollo (Gallus gallus) es un organismo de excelente modelo comúnmente utilizado en el campo de la biología. Su período de incubación es de aproximadamente 21 días y muchos huevos pueden incubarse simultáneamente, haciendo experimentación rápida y eficiente. Tal vez lo más importante, el embrión es también fácilmente manipulable, permite el estudio exhaustivo de procesos clave del desarrollo y de los genes y las proteínas que impulsan estos procesos.

El ojo de embrión de pollo es un órgano complejo que se desarrolla a través de la interacción de un número de diferentes tejidos similares a muchos otros sistemas del cuerpo. Este método permite el estudio del desarrollo de estos tejidos, especialmente en etapas avanzadas de desarrollo. Por ejemplo, la retina varias capas puede ser de particular interés para quienes estudian el desarrollo del sistema nervioso. Métodos alternativos que permiten el estudio de otros tejidos oculares como la córnea, el cuerpo de vitreal, la lente, la esclera y los párpados son de beneficio para los investigadores. El ojo de embrión de pollo también contiene una serie de huesos planos, los osículos esclerales, que pueden ser utilizados como un modelo para el estudio de inducción ósea intramembranosa y osificación en vertebrados1.

Actualmente, hay una serie de métodos utilizados para estudiar el desarrollo embrionario. Microinyecciones de anticuerpos inhibitorios u otras moléculas inhibidoras2,3, implantaron quirúrgicamente microbeads en inhibidor de la4, y electroporación5 son todos los métodos que pueden utilizarse para regular a la baja los genes o proteínas de interés en un embrión. Métodos similares se utilizan a las proteínas del alza. Estos métodos no están sin sus limitaciones. Por ejemplo, al utilizar productos químicos para alterar el desarrollo embrionario, los efectos letales sobre los embriones deben ser evaluados, y esto limita el uso de los métodos mencionados para sitios localizados de la aplicación en dosis lo suficientemente bajas para asegurar la supervivencia de la embrión.

In vitro cultivo de tejidos se ha utilizado en una amplia gama de organismos para el estudio de desarrollo y se puede utilizar para saltarse algunas de las limitaciones mencionadas. Por ejemplo, los fémures6pluma yemas7,8y miembros9 del pollo se todos han estudiado usando métodos de cultivo de tejidos como los testículos del ratón10 y las raíces y tallos de las plantas11. Estos métodos otorgan a los científicos un alto grado de control sobre el desarrollo de tejido, tales como la capacidad de fluctuar la temperatura y alterar la disponibilidad de nutrientes. El aislamiento de los tejidos del embrión entero también hace mucho menos susceptible a los efectos letales de sustancias químicas, lo que permite estudios de manipulación a escala global en concentraciones más altas. Otra ventaja notable de cultivo en vitro es la preservación del medio ambiente celular del tejido; el arreglo de los tejidos permanece relativamente sin cambios, lo que es posible estudiar las interacciones entre tipos de tejido diferentes9. Así, en vitro cultivo abre puertas a más experimental acercamientos no disponible en modelos en vivo o en ovo .

Actualmente, estudiando el desarrollo del ojo de pollo embrionario utilizando productos químicos es particularmente desafiante. Cubierta de una serie de membranas extraembrionarias del embrión, lo que hace difícil aplicar microesferas o productos químicos. el embrión también es muy activo dentro del huevo como se pone más viejo, complicando aún más un método ya difícil. Este protocolo permite el acceso fácil para el ojo y los tejidos circundantes, eliminando esas barreras, mientras que también proporciona nuevas oportunidades para examinar los procesos del desarrollo dentro del ojo. Este protocolo fue establecido para estudiar la inducción de los osículos esclerales en el ojo embrionario.

Protocol

Nota: Para las etapas de embrión, utilizar el Hamburger y Hamilton12 (HH) escenificando la mesa. 1. embrión incubación Incubar huevos de gallina fecundados en una incubadora estéril, control de temperatura a 37 ° C ± 1 ° C y 40% humedad. Gire los huevos 1 x por día y que puedan incubar a HH34 (8 días tras la fertilización). 2. preparación y esterilización de los materiales 12 embriones, autoclav…

Representative Results

Usando este método, un ojo de embrión de pollo puede cultivarse del día 8 de su desarrollo (HH34) en vitro durante 4 días. Cuatro días de desarrollo en ovo corresponde a HH38. Este método de cultivo apoya el desarrollo de brotes de plumas que rodean el ojo y los párpados (figura 1B). Estos brotes de plumas no están presentes en ovo en HH34 antes el cultivo (<strong…

Discussion

Este protocolo hace uso de técnicas de cultivo del tejido establecido para lograr el crecimiento de un ojo de pollo del día embrionario 8 (HH34) en vitro por 4 días. Este método de cultivo de rejilla fue descrito originalmente por Trowell15. Hemos optimizado un protocolo de Pinto y Hall 1991 estudio16 utilizando una membrana semi porosa con la red para el estudio de señales inductivas entre capas de tejido separadas del embrionario pollo ojo1…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer Gregory Haller (Universidad de Mount Saint Vincent) para sus trabajos preliminares en el desarrollo del protocolo. Los autores también gustaría agradecer Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) por su experiencia técnica y asistencia con el rodaje y producción de la parte audiovisual del manuscrito. Daniel Andrews fue apoyado por fondos de MSVU y las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) a través de un premio de investigación del estudiante de pregrado. Tamara A. Franz-Odendaal es apoyada por una subvención de descubrimiento de NSERC.

Materials

35 mm cell culture petri dishes Corning 353001 easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes Corning 353003 tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue Kimtech 34155 Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh n/a n/a stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes VWR 14673-010 Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium Gibco 12591-038 Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4458 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper Whatman 1454 090 semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs Dalhousie University Agricultural College n/a can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl) EMD SX0420-3 sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle VWR 89000-240 1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol Fisher Scientific BP82011 70% molecular biology grade
tupperware containers n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades VWR 55411-050 single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons n/a n/a store-bought and sterilized with EtOH
dust mask 3M n/a 3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin Fisher Scientific 72210 10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS) n/a n/a 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes VWR 21008-216 presterilized centrifuge tubes
forceps FST n/a fine forceps
chick saline  n/a n/a  0.85% NaCl
tinfoil n/a n/a store-bought
paper towel n/a n/a store-bought

References

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Cite This Article
Andrews, D. D. T., Franz-Odendaal, T. A. Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues. J. Vis. Exp. (138), e57619, doi:10.3791/57619 (2018).

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