Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar
Summary
Burada, köklerinin genç farelerin kültürlü yumurtalık içinde seri kesit olmadan ölçmek için bir protokol mevcut. Ayirt bütün organ ve doku takas kullanarak, fiziksel kesit optik kesit ile değiştirilir. Bu yöntem örnek hazırlama ve görselleştirme organ bütünlüğü korur ve belirli hücre otomatik miktar kolaylaştırır.
Abstract
Memeli üreme biyolojisi alanında araştırma sık sık yumurtalıklar ve testis genel sağlık değerlendirme içerir. Özellikle, kadın, yumurtalık fitness kez görselleştirme ve köklerinin ve yumurta miktarının değerlendirilir. Çünkü yumurtalık opak bir üç boyutlu dokusu, geleneksel yaklaşımlar zahmetle doku hücreleri tüm organ boyunca görselleştirmek için çok sayıda seri bölümlere Dilimleme gerektirir. Ayrıca, miktar tarafından bu yöntem genellikle yalnızca bir alt kümesini bir oosit yaklaşık çapı tarafından ayrılan bölümler puanlama gerektirir çünkü yanlışlık için eğilimli olduğunu. Burada, bir iletişim kuralı yerine tüm organ doku takas ve köklerinin ve yumurta görselleştirmek için fare yumurtalık ayirt boyama kullanan açıklanmıştır. Daha geleneksel yaklaşımlar, bu iletişim kuralını yumurtalık hücrelerde çok sayıda nedenlerle görselleştirme için avantajlı karşılaştırılır: 1) yumurtalık numune hazırlama ve işleme; bozulmadan kalır 2) bölüm için zor olan küçük yumurtalıkların, kolaylıkla incelenebilir; 3) hücresel miktar daha kolay ve doğru bir şekilde elde edilir; ve 4) yansıma tüm organ.
Introduction
Hücresel kompozisyon ve memeli yumurtalık morfolojik özelliklerinin çalışması için bilim adamları çoğunlukla parafin gömülü yumurtalık immunohistological boyama tarafından takip vivo deneyler kullanır. Son zamanlarda tüm yumurtalık organı kültür tekniği daha iyi görselleştirme ile birleştiğinde olabilir çünkü yumurtalık işlev1,2,3,4 çalışma için etkili bir alternatif olduğu ispatlanmıştır rağmen daha fazla ve miktar araçları. Geleneksel olarak, yeniden inşa üç boyutlu yumurtalık mimari gömülü parafin seri bölümlerden ama zahmetli ve zaman tüketmek, seri olarak gömülü parafin doku kesit olmanın yanı sıra yumurtalık Morfoloji analizi bağlıdır değil garanti uygun yeniden yapılanma organ yapar ve bölümler kez kaybolan veya süreç içinde yanlış emretti.
Teknik sorunlar seri kesit ile ilişkili ek olarak, ayrıca düzenli olarak yumurtalık5,6başına folikül numara ölçmek için kullanılan yöntemleri değişimler vardır. Şu anda kullanılan metodolojik değişkenlik meta-analiz yumurtalık rezervinin çalışmaları5,7bozar. Örneğin, farklı araştırma makaleleri folikül numaralardan 10 kat veya daha fazla belirli zorlanma6içinde benzer gelişimsel yaş arası değişebilir. Bu büyük farklılıklar bildirilen folikül miktar karışıklığa yol açabilecek ve çapraz-çalışma karşılaştırmalar engel. Deneysel, folikül miktar geleneksel yaklaşımlar seri bölümlerden bölümleri önceden tanımlanmış bir dizi köklerinin sayarak gerçekleştirilir (Örneğin, her beşinci, onuncu, veya diğer bölüm). Bu yaklaşımı kullanarak folikül sayıları değişkenlik değil sadece hangi bölümlerin sayılır içinde periyodik olarak aynı zamanda varyasyonlarından bölüm kalınlığı ve seri bölümler5,6üreten teknik deneyim ortaya çıkar. Onun değişkenliği ek olarak, geleneksel doku kesit başka bir dezavantaj genç hayvanlardan küçük yumurtalıkların kesit özellikle zorlu ve doku yönlendirme8son derece bağımlı olmasıdır.
İletişim kuralı aşağıdaki rutin olarak kullanılan yumurtalık kültür tekniği1 açıklanır ama fiziksel takas doku ile kesit ve optik confocal mikroskopi8 kullanarak kesit yerine kullanarak geleneksel folikül miktar geliştirir ,9. Bir üre ve sorbitol-tabanlı içinde doku daldırma (ezelî belgili tanımlık lüzum için Transkraniyal perfüzyon veya Elektroforez) kullanarak Temizleme (Örneğin, ScaleS(0)10) çözüm immunostaining ile uyumlu olduğunu kanıtladı ve azaltılması için izin zaman görüntüleme derinliğini ödün vermeden temizlemek. Diğer bildirilen yolu (örneğin, ScaleA28,10, SeeDB11, berrak12ve ClearT212) ya daha fazla zaman alıcı veya derinlemesine optik çözünürlük örnek izin vermez. O daha az emek yoğun olması ve organ’ın üç boyutlu mimari7,8tutar optik kesit avantajlıdır. Örnekleri hazırlanması doku temizlemek için pahalı reaktifler gerektirmez ve göreli kolaylıkla yapılabilir Bu yaklaşımın başka bir şeydir.
Özellikle, açıklanan protokol kültürlü fare yumurtalık için doğum sonrası gün beş optimize edilmiş ama doğum sonrası gün 0 – 10 arasında değişen yumurtalıklarda gerçekleştirilmiştir. Yöntem doku doğal olarak membran üzerinde bu kültürlü, organ işleme ve işleme kolaylaştırmak için verdiği bir yumurtalık kültür sistemi kullanır. Açıklanan kültür sistemi 10 güne kadar ve ne kadar farklı deneysel koşullar değerlendirmek için explanted yumurtalıkların yumurta hayatta kalma13ile girişime neden olabilir korumak için kullanılabilir. Açıklanan miktar yordam ticari olmayan görüntü işleme paket FIJI-ImageJ14 kullanılarak gerçekleştirilir ve çoğu kişisel bilgisayarda yapılabilir. Ayrıca, miktar için kullanılan görüntüleri böylece gelecek meta-analiz için izin bilimsel topluluk için yaygın olarak kullanılabilir duruma getirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli üreme çalışma kullanarak ve hücre kültürü için rutin olarak mükellef olmayan özel hücreler miktarının gerektirir. Ancak, ex vivo kültür sistemleri yumurtalık ve folikül canlılık1,15Bakımı etkilidir. Yumurtalık kültür sırasında doku Difüzyon yoluyla besin alışverişini için geniş bir yüzey alanı gerektirir. Bu nedenle, yumurtalık boyutunda idealdir ve şekil organ kültür için 5 – gün eski fare. Bu iletişim ku…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Rebecca Williams ve Cornell BRC görüntüleme Johanna Dela Cruz ve Andrew Recknagel yararlı öneriler ve teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık grant Enstitüleri için desteklenen S10-OD018516 (için Cornell tesis görüntüleme), T32HD057854 J.C.B. için ve R01-GM45415 J.C.S. için
Materials
| Micro dissecting scissor 4.5", straight, sharp points | Roboz | RS-5912 | Micro dissecting scissor |
| Jewelers style forceps 4-3/8", style 5 | Integra Miltex | 17-305X | Fine tip forceps |
| Micro Iris Scissors 4", straight, sharp points | Integra Miltex | 18-1618 | Micro dissecting iris scissor or micro dissecting spring scissor |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fetal Bovine Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | Used in Step 1.3.1 |
| 35mm Tissue Culture Treated Dish | Corning | 430165 | |
| Nunc™ 24-Well Carrier Plate for Cell Culture Inserts | ThermoFisher Scientific | 141006 | Pore size: 8μm |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| 1X Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutator mixer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | three dimensional shaker |
| Normal Goat Serum | VWR | 103219-578 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium borohydride solution (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Use the solution, rather than the tablet or powder form |
| Polyvinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Cold water soluble |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
| Syringe filters | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Syringes | BD | 309695 | |
| Mouse anti-p63 antibody (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Dilution 1:500 |
| Rabbit anti-MVH antibody | Abcam | ab13840 | Dilution 1:600 |
| Alexa Fluor® goat anti-mouse 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Dilution 1:1000 |
| Alexa Fluor® goat anti-rabbit 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Dilution 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Image processing software | ||
| Disposable plastic transfer pipettes | VWR | 414044-034 |
References
- O’Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
- Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -. J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
- Tilly, J. L. Ovarian follicle counts – not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).
- Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
- Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242 (2015).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497 (2002).
- Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
- Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10 (2011).
- Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, (2017).
