Al fine di studiare la composizione cellulare e caratteristiche morfologiche delle ovaie dei mammiferi, gli scienziati spesso si affidano in vivo esperimenti seguiti dalla macchiatura immunohistological delle ovaie di paraffina. Più recentemente comunque, coltura di organo intero ovaio ha dimostrato di essere un’alternativa efficace per studiare la funzione ovarica^1,2,3,4 perché la tecnica può essere accoppiata con migliore visualizzazione e strumenti di quantificazione. Tradizionalmente, analisi della morfologia ovarica dipende dalla ricostruzione tridimensionale ovarico architettura dalla paraffina sezioni di serie, ma, oltre ad essere laboriosa e richiede tempo, sezionamento in serie del tessuto paraffina non garanzia di ricostruzione adeguata dell’organo, e sezioni sono spesso persi o mis-ordinati nel processo.

Oltre le sfide tecniche associate di sezionamento seriale, ci sono inoltre variazioni nei metodi abitualmente utilizzati per quantificare numeri follicolo per ovaia^5,6. La variabilità metodologica attualmente utilizzata altera la meta-analisi della riserva ovarica attraverso studi^5,7. Ad esempio, numeri di follicolo da articoli di ricerca diversi possono variare da 10 volte o più tra simili età inerente allo sviluppo all’interno di un ceppo specifico⁶. Queste grandi differenze nella quantificazione riferito follicolo possono portare a confusione e hanno ostacolato i confronti Croce-Studio. Sperimentalmente, gli approcci tradizionali alla quantificazione del follicolo da sezioni di serie vengono eseguiti da follicoli di un numero predeterminato di sezioni di conteggio (ad esempio, ogni quinto, decimo, o altra sezione). Variabilità nei conteggi di follicolo utilizzando questo approccio deriva non solo dalla periodicità in quali sezioni sono contati, ma anche da variazioni di spessore della sezione e l’esperienza tecnica nella generazione di sezioni di serie^5,6. Oltre alla sua variabilità, un altro svantaggio del taglio di tessuto tradizionale è che il sezionamento delle ovaie piccole dagli animali giovani è particolarmente difficile e dipende molto dal tessuto orientamento⁸.

Il protocollo sottostante descrive un ovaio ordinariamente usato cultura tecnica¹ ma migliora notevolmente sulla quantificazione del follicolo tradizionale sostituendo sezionamento fisico con il tessuto di compensazione e sezionamento ottico mediante microscopia confocale^{8 ,9}. Pulizia con immersione del tessuto (senza la necessità di transcranial aspersione o elettroforesi) in un – e sorbitolo-a base di urea soluzione (ad es., ScaleS(0)¹⁰) si è rivelato compatibile con immunostaining e ammessi per la riduzione del tempo di compensazione senza compromettere la profondità dell’imaging. Altri metodi segnalati (ad es., ScaleA2^8,10, SeeDB¹¹, clean¹²e ClearT2¹²) sono più tempo che consumano o non consentono approfondita risoluzione ottica del campione. Sezionamento ottico è vantaggioso perché è meno laborioso e mantiene l’architettura tridimensionale^{7,8 dell’organo}. Un altro vantaggio di questo approccio è che la preparazione dei campioni non richiede costosi reagenti per cancellare il tessuto e può essere condotta con relativa facilità.

In particolare, il protocollo descritto è stato ottimizzato per le ovaie coltivati del topo al quinto giorno postnatale ma è stato condotto su ovaie che vanno dal giorno postnatale 0 – 10. Il metodo si avvale di un sistema di cultura dell’ovaia in cui il tessuto naturalmente si attacca alla membrana su cui è coltivato, facilitando l’utilizzo dell’organo e manipolazione. Il sistema di cultura descritto può essere utilizzato per mantenere explanted ovaie per fino a 10 giorni e di valutare come le diverse condizioni sperimentali possono interferire con ovocita sopravvivenza¹³. La procedura di quantificazione descritta viene eseguita utilizzando il pacchetto FIJI-ImageJ¹⁴ di elaborazione delle immagini non commerciali e può essere condotta sulla maggior parte dei personal computer. Inoltre, immagini utilizzate per la quantificazione possono essere reso ampiamente disponibile per la comunità scientifica, consentendo in tal modo futura meta-analisi.