Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri
Summary
Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.
Abstract
Cultures des macrophages dérivés de cellules dendritiques (RCSCND) générés à partir de moelle osseuse de souris à l’aide de Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) ont récemment été reconnus plus hétérogènes qu’auparavant. Ces cultures contiennent systématiquement RCSCND dérivées de monocytes et macrophages (moMac) et même des cellules moins développées telles que les monocytes. Le but du présent protocole est de fournir une méthode cohérente pour l’identification et la séparation des nombreux types de cellules présents dans ces cultures à mesure qu’ils développent, afin que leurs fonctions spécifiques peuvent être davantage étudiées. La stratégie triage présentée ici sépare de cellules tout d’abord en quatre populations basées sur l’expression de Ly6C et CD115, qui sont exprimés transitoirement par les cellules comme ils se développent dans la culture GM-CSF-driven. Ces quatre populations comprennent des progéniteurs myéloïdes communs ou CMP (Ly6C, CD115), progéniteurs de granulocytes/macrophage ou GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +) et les macrophages dérivés de monocytes ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c est également ajouté à la stratégie de tri pour distinguer deux populations au sein de la Ly6C-, CD115-population : CMP (CD11c-) et RCSCND (CD11c +). Enfin, deux populations peuvent être plus distinguées au sein de le Ly6C, CD115 + population en se basant sur le niveau de MHC classe expression II. MoMacs expriment des niveaux inférieurs du CMH de classe II, alors qu’un précurseur des DC de macrophages dérivés de monocytes (moDP) exprime plus MHC classe II. Cette méthode permet l’isolation fiable de plusieurs populations distinctes développemental en nombre suffisante pour une variété d’analyses fonctionnelles et du développement. Nous mettons en évidence une telle lecture fonctionnelle, les réponses différentielles de ces types de cellules à une stimulation par Pathogen-Associated profils moléculaires (PAMPs).
Introduction
Mise en culture des cellules de moelle épinière murin avec la cytokine Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) est largement utilisé comme une méthode pour générer des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes (RCSCND ; également connu sous le nom DC inflammatoire) dans un grand nombre 1, 2,3,4,5. Ces cellules ont été extrêmement utiles pour une variété d’études de cellules dendritiques (DC) fonction 6,7,8. En règle générale, ces cellules de la moelle épinière murin sont cultivés pendant 6 à 8 jours et sont ensuite utilisés pour l’étude de la fonction des cellules dendritiques 5. Ces cultures avaient longtemps été considérée comme essentiellement homogènes, composé d’une majorité de RCSCND différenciée. Plus récemment, il est devenu clair qu’à la fin de cette période de culture de 6 à 8 jours, il existe en effet de nombreux RCSCND, ainsi qu’un large sous-ensemble de différenciée macrophages dérivés de monocytes (moMacs) 9,10,11. Nos études ont étendu ces résultats démontrant que les autres sous-ensembles de moins développés de cellules, telles que RCSCND précurseurs (moDP) et les monocytes, restent dans les cultures à faible fréquence même après 7 jours, 10. Ainsi, des études de la fonction des cellules dendritiques (DC) à l’aide de cellules générées par ce système pourraient refléter les réponses d’une cohorte plus large de types de cellules que précédemment apprécié.
Nous avons appris beaucoup de choses de l’étude de GM-CSF-généré RCSCND relatives à la fonction de ces cellules au stade final de différenciation 12,13,14. Toutefois, nous comprenons beaucoup moins sur la voie du développement de ces cellules 2,15,16 et de comment et quand ils présentent des fonctions telles que : réactivité à Pathogen Associated Molecular Modèles (PAMPs), phagocytose, antigène traitement et présentation 13et activité anti-bactérienne. Un protocole pour l’isolement d’un grand nombre de classiques progéniteurs axée sur les Flt3L DC et de précurseurs a été rapporté 17. Isolement de ces populations distinctes a été réalisée à l’aide de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)-coloration des cellules de moelle osseuse (pour suivre la Division des cellules) et de la culture en Flt3L pendant 3 jours. Cellules étaient alors appauvrit les cellules positives linage et triés en populations ancêtre et précurseur basées sur CD11c expression 17. Une autre approche par groupe de Leenen pour identifier les progéniteurs précoces de DC en culture GM-CSF-driven devait trier les cellules basées sur CD31 et Ly6C 18. Le but initial était de créer une méthode similaire pour l’obtention des progéniteurs et précurseurs du GM-CSF-driven RCSCND. Les types de cellules spécifiques générées par le GM-CSF, nous avons adapté l’approche et la stratégie basée sur l’expression des molécules qui ont été exprimées au début et plus tard des stades de développement de tri. En fin de compte, nous avons déterminé que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), et CD11c ont été les meilleurs marqueurs pour distinguer ces cellules type 10.
Ici, nous présentons une méthode pour isoler des cellules à plusieurs étapes distinctes de développement le long de la voie de la différenciation par le GM-CSF : monocyte progéniteur myéloïde commun (CMP), Granulocyte-Macrophage progénitrices (GMP), macrophages dérivés de monocytes (MoMac) et les macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND). La population de moMac peut être plus séparée basés sur le niveau de MHC classe expression II, révélant un RCSCND précurseur population (moDP) 10. Nous utilisons une cellule de fluorescence-lancée à grande vitesse tri stratégie (FACS) afin d’isoler ces 5 populations basées sur l’expression de Ly6C, CD115 et CD11c. Ensuite, nous démontrons l’examen de ces cellules dans des essais fonctionnels révélant leurs réponses à la stimulation de PAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole facilite l’isolement de GM-CSF-driven ancêtre et précurseur types cellulaires en nombre suffisant pour plusieurs types d’analyses dont les épreuves biochimiques, les tests de la fonction cellulaire in vitroou in vivode l’instillation. Cette méthode représente une avancée significative dans le domaine du développement des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes, permettant l’isolation fiable et l’identification des cellules au début de cette voie de dévelo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique de l’église de Alison Bird à l’Auburn University de médecine vétérinaire Flow Cytometry établissement scolaire, pour le financement du NIH pour EHS R15 R15 AI107773 et le cellulaire et le programme de biologie moléculaire à l’Université d’Auburn pour financer la recherche été au PBR.
Materials
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HEPES buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23-gauge needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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