Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Kan – beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan – beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur^1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler ^{, 6 , 7}. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu^8,9, takip ¹⁰. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan – beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz–dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan – beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.

1969 yılında, Siakotos ve ark. ¹¹ ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. ¹² bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme^13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. ¹⁶ sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990’ların başında Dallaire ve ark. ¹⁷ nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000’de, Miller ve ark. ¹⁸, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)^19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)^22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)²⁴ taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. ²¹, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ET_B) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. ¹⁹, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek²⁵tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım ²⁶ ‘ yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)₄₀ve Aβ₄₂beyin düzeyleri azaltılacağını.

Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan – beyin bariyerini²fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı^{27,28,29, 30}. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler^{31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37}. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan – beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere^{38 karşılaştırıldığında ile gösterdi} . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.

Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan – beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin^{39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44}. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan – beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).

Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır ^{45 , 46}. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.

Betz vd. ⁴⁷ monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan – beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları^48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan – beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak^51, polarize ifade içeren ⁵². ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri⁵²onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.

Kan – beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi^53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil ^{54 , 55}. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu “blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu “kan” ve “beyin” bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar⁵⁶ altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır ^{, 57 , 58}. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan – beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.

Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma^5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.

Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan – beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri^3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.

Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar⁶⁵için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan – beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.

Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan – beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.