بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة
Summary
ويقدم بروتوكول لاستخلاص نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة تربة واحدة في وقت واحد، مما يسمح عينة انخفاض إعداد مرات وتمكين متعدد omic الكتلي تحاليل العينات بكميات محدودة.
Abstract
الطيف الكتلي (مللي ثانية)-ميتابروتيوميك متكامل يستند إلى، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك (multi-أوميك) في تحويل قدرتنا على فهم وتميز المجتمعات الميكروبية في النظم البيئية والبيولوجية. هذه القياسات حتى تمكن التحليلات المعززة للمجتمعات الميكروبية التربة المعقدة، التي أكثر النظم الميكروبية المعقدة المعروفة حتى الآن. تحليلات متعددة-أوميك، ومع ذلك، قد التحديات إعداد عينة، منذ عمليات الاستخراج منفصلة مطلوبة عادة لكل دراسة أوميك، إلى حد كبير وبالتالي تضخيم إعداد الوقت وكمية العينة المطلوبة. لمعالجة هذا القيد، تم إنشاء أسلوب 3 في 1 لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون (مبليكس) من نفس العينة التربة بتكييف نهج قائم على أساس مذيب. أثبت هذا البروتوكول مبليكس على حد سواء بسيطة وقوية للعديد من أنواع العينات، حتى عندما تستخدم لكميات محدودة من عينات التربة المعقدة. الأسلوب مبليكس كبير أيضا تمكين القياسات المتعددة-أوميك السريع اللازم للحصول على فهم أفضل لأعضاء كل جماعة الميكروبية، أثناء تقييم التغيرات التي تحدث عند الاضطرابات البيولوجية والبيئية.
Introduction
تقييم المجتمعات الميكروبية في التربة آثار هامة لفهم الكربون ركوب الدراجات، وتغير المناخ. قد أبرزت الدراسات الأخيرة لكن الصعوبات، مثل عدم وجود تسلسل الجينوم الحجمية في مختلف أنواع التربة والدالة غير معروف للعديد من البروتينات الكشف عن. هذه نتيجة التحديات نظراً للتربة يجري المجتمع الميكروبي أعقد المعروفة حتى الآن1،،من23. تحليلات متعددة-أوميك، التي تجمع بين النتائج من الجينومية، ميتاترانسكريبتوميك، ميتابروتيوميك، metabolomic، والدراسات ليبيدوميك، قد نفذت مؤخرا في العديد من الدراسات التربة على اكتساب فهم أكبر في الميكروبات الحالية، بينما الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجزيئية التي تحدث بسبب الاضطرابات البيئية1،،من45. التحدي واحدة مع دراسات متعددة-أوميك هو أن الكتلي (مللي ثانية)-استناداً إلى قياسات ميتابروتيوميك، metabolomic، ليبيدوميك، وعادة ما تتطلب عملية استخراج محددة لكل أوميك أن يكون مرض التصلب العصبي المتعدد متوافق مع6،7 , 8 , 9-هذه الإجراءات الدقيقة جعل تنفيذها صعباً أو مستحيلاً للغاية عندما فقط تتوفر كمية محدودة من عينة. هذه التحديات قد حدا بنا إلى التحقيق في أسلوب متزامنة من استخراج (مبليكس) المستقلب والبروتين والدهن قادرة على استخدام أصغر حجم العينة أو الجماهير، وتحسين دقة وتوفير الاستعدادات عينة أسرع لجميع التحاليل الثلاثة 10-حتى الآن، لا توجد أي إجراءات استخراج التربة البديلة التي يمكن تحقيق كل هذه الأهداف.
لتمكين تحليلات عالمية متعددة-أوميك من عينة التربة واحدة، كان بروتوكولا استخلاص بالمذيبات عضوية استناداً إلى كلوروفورم، والميثانول، وفصل المياه المستخدمة10. هذا الأسلوب وضعت أصلاً للدهن مجموع الاستخراج9،11 ، وفي الآونة الأخيرة عدل لاستخراج متزامنة من نواتج الأيض، والبروتينات، والدهون من عينة واحدة12،13 ،14،15،16،17،،من1819،،من2021،22، 23،24،25،26،27،28،،من2930، تمكين أقل كمية العينة و 10من تقلب التجريبية. في بروتوكول مبليكس، كلوروفورم ليس الامتزاج مع الماء، مما يوفر الأساس لفصل مكونات عينة ثلاثية الأطوار الكيميائية إلى كسور متميزة. ولذلك تتضمن المرحلة مائي أعلى والايضات ماء، متبوعة بقرص بروتين، ومن ثم طبقة الدهون في مرحلة كلوروفورم السفلي (الشكل 1). عندما يتم تطبيق مبليكس على معظم أنواع التربة، جسيمات الحطام يتراكم في الجزء السفلي من أنابيب أخذ العينات ويمكن التخلص منها بعد أن يتم جمع كل الطبقات. كل نوع من أنواع التربة يمكن أن تكون مختلفة، ومع ذلك، وفي التربة العضوية العالية مثل الخث، والحطام التربة يبقى في الطبقة الوسطى، ولا تقع على الجزء السفلي من أنبوب أخذ العينات. مبليكس يوفر العديد من المزايا عند عزل جزيء عدة أنواع من نفس العينة مثل كميات 1) أصغر بعينه يمكن أن تستخدم لتحليلات متعددة-أوميك، 2) multi-omic الاستخراج من النقصان عينة نفس تقلب التجريبية عموما، و 3) يمكن إعداد أسرع بكثير عدد أكبر من العينات ل دراسات الإنتاجية أعلى10. معا هذه الفوائد أمر حيوي لتوفير قدرات القياس بشكل أفضل لتقييم عينات التربة ومجتمعاتهم الجرثومية المعقدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم أن نلاحظ أن ليس جميع المختبرات سوف يكون نفس المعدات المتاحة حتى يمكن تكييف أساليب معينة، وعلى سبيل المثال فإن الخطوة تحلل،. هنا نستخدم فورتيكسينج وسونيكاتينج، أن استخدام الخافق حبة كبيرة 50 مل العمل. إذا لم يتوفر ليوفيليزير مع درجة حرارة جامع قادر على-105 درجة مئوية، ثم يمكن أن تجفف …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر ناثان جونسون لمساعدته في إعداد الأرقام. هذا البحث وأيده اوميكس عموم البرنامج الذي تموله وزارة الطاقة الأمريكية مكتب البيولوجية والبحوث البيئية (برنامج العلوم المجيني)، ميكروبيوميس في المرحلة الانتقالية (النعناع) “مختبر الموجهة للبحث والتطوير” المبادرة في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ، فضلا عن الوطنية معاهد للصحة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (R01 ES022190)، والمعاهد الوطنية للصحة (P42 ES027704). كيبج يود أن يشكر R21 HD084788 لتقديم الدعم المالي لتطوير والتحقق من صحة رواية متعددة-omic تقنيات الاستخراج. هذا العمل قد أنجز في جورج ر. إيلي البيئية الجزيئي العلوم المختبرية (امسل)، منشأة الكيان التشغيلي المعين لمستخدم علمية وطنية في المختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ (بننل). بننل برنامج متعدد مختبر وطني تشغلها Battelle للكيان التشغيلي المعين تحت العقد دي-AC06-76RL01830.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
- Hultman, J., et al. Multi-omics of permafrost, active layer and thermokarst bog soil microbiomes. Nature. 521, 208-212 (2015).
- White, R. A., et al. Moleculo long-read sequencing facilitates assembly and genomic binning from complex soil metagenomes. mSystems. 1, (2016).
- White, R. A., Callister, S. J., Moore, R. J., Baker, E. S., Jansson, J. K. The past, present and future of microbiome analyses. Nat Protoc. 11, 4-8 (2016).
- Ritchie, M. D., Holzinger, E. R., Li, R., Pendergrass, S. A., Kim, D. Methods of integrating data to uncover genotype-phenotype interactions. Nat Rev Genet. 16, 85-97 (2015).
- Jansson, J. K., Baker, E. S. A multi-omic future for microbiome studies. Nat Microbiol. 1, (2016).
- Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nat Biotechnol. 28, 710-721 (2010).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10, 19-22 (2013).
- Roberts, L. D., Souza, A. L., Gerszten, R. E., Clish, C. B. Targeted metabolomics. Curr Protoc Mol Biol. , (2012).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497-509 (1957).
- Nakayasu, E. S., et al. MPLEx: a Robust and Universal Protocol for Single-Sample Integrative Proteomic, Metabolomic, and Lipidomic Analyses. mSystems. 1, (2016).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Pomraning, K. R., et al. Multi-omics analysis reveals regulators of the response to nitrogen limitation in Yarrowia lipolytica. BMC Genomics. 17, 138 (2016).
- Tisoncik-Go, J., et al. Integrated Omics Analysis of Pathogenic Host Responses during Pandemic H1N1 Influenza Virus Infection: The Crucial Role of Lipid Metabolism. Cell Host Microbe. 19, 254-266 (2016).
- Kyle, J. E., et al. Uncovering biologically significant lipid isomers with liquid chromatography, ion mobility spectrometry and mass spectrometry. Analyst. 141, 1649-1659 (2016).
- Lovelace, E. S., et al. Silymarin Suppresses Cellular inflammation by inducing reparative stress signaling. J Nat Prod. 78, 1990-2000 (1990).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Front Microbiol. 6, 209 (2015).
- Pomraning, K. R., et al. Comprehensive Metabolomic, Lipidomic and microscopic profiling of Yarrowia lipolytica during lipid accumulation identifies targets for increased lipogenesis. PLoS One. 10, e0123188 (2015).
- Huang, E. L., et al. The fungus gardens of leaf-cutter ants undergo a distinct physiological transition during biomass degradation. Environ Microbiol Rep. 6, 389-395 (2014).
- Deatherage Kaiser, B. L., et al. A Multi-Omic View of Host-Pathogen-Commensal Interplay in Salmonella-Mediated Intestinal Infection. PLoS One. 8, e67155 (2013).
- Kim, Y. M., et al. Salmonella modulates metabolism during growth under conditions that induce expression of virulence genes. Mol Biosyst. 9, 1522-1534 (2013).
- Ansong, C., et al. A multi-omic systems approach to elucidating Yersinia virulence mechanisms. Mol Biosyst. 9, 44-54 (2013).
- Bordbar, A., et al. Model-driven multi-omic data analysis elucidates metabolic immunomodulators of macrophage activation. Mol Syst Biol. 8, 558 (2012).
- Hu, Z. P., et al. Metabolomic response of human skin tissue to low dose ionizing radiation. Mol Biosyst. 8, 1979-1986 (2012).
- Perera, R., et al. Dengue virus infection perturbs lipid homeostasis in infected mosquito cells. PLoS Pathog. 8, e1002584 (2012).
- Gao, X., et al. A reversed-phase capillary ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) method for comprehensive top-down/bottom-up lipid profiling. Anal Bioanal Chem. 402, 2923-2933 (2012).
- Sorensen, C. M., et al. Perturbations in the lipid profile of individuals with newly diagnosed type 1 diabetes mellitus: Lipidomics analysis of a Diabetes Antibody Standardization Program sample subset. Clin Biochem. 43, 948-956 (2010).
- Diamond, D. L., et al. Temporal proteome and lipidome profiles reveal hepatitis C virus-associated reprogramming of hepatocellular metabolism and bioenergetics. PLoS Pathog. 6, e1000719 (2010).
- Alquier, T., et al. Deletion of GPR40 impairs glucose-induced insulin secretion in vivo in mice without affecting intracellular fuel metabolism in islets. Diabetes. 58, 2607-2615 (2009).
- Ding, J., et al. Application of the accurate mass and time tag approach in studies of the human blood lipidome. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 871, 243-252 (2008).
- Rasmussen, A. L., et al. Systems virology identifies a mitochondrial fatty acid oxidation enzyme, dodecenoyl coenzyme A delta isomerase, required for hepatitis C virus replication and likely pathogenesis. J Virol. 85, 11646-11654 (2011).
- Manza, L. L., Stamer, S. L., Ham, A. J., Codreanu, S. G., Liebler, D. C. Sample preparation and digestion for proteomic analyses using spin filters. Proteomics. 5, 1742-1745 (2005).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 6, 359-362 (2009).
- Zhou, J. Y., et al. Simple sodium dodecyl sulfate-assisted sample preparation method for LC-MS-based proteomics applications. Anal Chem. 84, 2862-2867 (2012).
- Anderson, J. C., et al. Decreased abundance of type III secretion system-inducing signals in Arabidopsis mkp1 enhances resistance against Pseudomonas syringae. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 6846-6851 (2014).
- Chourey, K., et al. Direct cellular lysis/protein extraction protocol for soil metaproteomics. J Proteome Res. 9, 6615-6622 (2010).
- Kim, S., Gupta, N., Pevzner, P. A. Spectral probabilities and generating functions of tandem mass spectra: a strike against decoy databases. J Proteome Res. 7, 3354-3363 (2008).
- Kim, S., Pevzner, P. A. MS-GF+ makes progress towards a universal database search tool for proteomics. Nat Commun. 5, 5277 (2014).
- Cole, J. K., et al. Phototrophic biofilm assembly in microbial-mat-derived unicyanobacterial consortia: Model systems for the study of autotroph-heterotroph interactions. Front Microbiol. 5, (2014).
- Isaacson, T., et al. Sample extraction techniques for enhanced proteomic analysis of plant tissues. Nat Protoc. 1, 769-774 (2006).
