ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化
Summary
ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ ラインを作成するプロセスを示す、魚腫瘍細胞の生体内で。
Abstract
生体電気、イオン チャネルを介する内因性電気シグナル伝達と細胞膜にあるポンプなど興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスおよび他の多くの生物学的プロセスのシグナル伝達に重要な役割を果たしている萌芽期発達のパターン。しかし、生体内で電気的活動は、脊椎動物の胚発生の監視の必要性があります。遺伝的コード化蛍光電圧インジケーター (GEVIs) の進歩はこのような課題に対してソリューションを提供する可能にしました。ここでは、確立された電圧インジケーター、ASAP1 を用いたトランスジェニック電圧インジケーター ゼブラフィッシュを作成する方法について説明 (加速センサーの活動電位 1)、例として。メダカ Tol2 キットとユビキタス ゼブラフィッシュ プロモーター、ユービーアイは本研究で選ばれました。我々 はまた、ゲートウェイ サイト固有のクローニング、メダカ Tol2 トランスポゾンを用いたゼブラフィッシュ遺伝子と正規 epifluorescent 顕微鏡を使用して初期段階魚胚および魚腫瘍イメージング プロセスのプロセスを説明します。この魚のラインを使用すると、ゼブラフィッシュ胚発生と魚の幼虫の動きの間に細胞の電気電圧の変化があることがわかった。さらに、いくつかのゼブラフィッシュ悪性末梢神経鞘腫瘍の周囲の正常組織に腫瘍細胞が一般に偏極が比較して観察されました。
Introduction
生体電気は、イオン チャネルと1の細胞膜にあるポンプを介する内因性電気信号を指します。細胞膜と結合電気潜在的な現在の変化の間でイオン交換が興奮性神経細胞と筋肉細胞のプロセスを通知するに不可欠です。さらに、生体電気とイオン勾配エネルギー貯蔵、生合成および代謝産物の輸送を含む他の重要な生物学的機能のさまざまながあります。生体信号は、体軸、細胞周期、細胞分化1などの胚パターン形成の調節因子としても発見されました。したがって、シグナリングのこのタイプの誤規制から生じる多くの人間の先天性疾患を理解するために重要です。パッチク ランプは、単一のセルを記録するため広く使用されています、萌芽期の開発の生体の中に複数のセルの同時モニタリングのための理想には程遠いです。また、電圧敏感な小さな分子はまた生体内特異性、感度、毒性などのアプリケーションに最適ではありません。
多様性の創出遺伝子蛍光電圧インジケーター (GEVIs) を提供していますこの問題を克服するために新しいメカニズムをエンコードでき、萌芽期の開発の研究を簡単に適用にもかかわらず、本来神経を監視するためだった2,3のセルします。現在利用可能な GEVIs の 1 つは加速センサーの活動電位 1 (ASAP1)4です。それは電圧敏感なホスファターゼと円形に置換された緑色蛍光タンパク質の電位センサー ドメインの細胞外ループで構成されます。したがって、ASAP1 は、細胞電位変化の可視化 (偏波: 明るい緑色; 脱分極: ダーク グリーン)。ASAP1 が 2 ms オンとオフ反応ありサブスレッショルド潜在的な変更4を追跡することができます。したがって、この遺伝子解析ツールは生きているセルのリアルタイム生体監視機能の有効性の新しいレベルのことができます。萌芽期の開発で多くの人間の病気、癌などの生体電気の役割のさらなる理解が新しいに光を当てるメカニズム, 病気の治療と予防のために重大であります。
ゼブラフィッシュは、発生生物学、がん5,6を含む人間の病気の研究に強力な動物モデルを実証されています。彼らは、人間とオーソログ遺伝子の 70% を共有して同様の脊椎動物の生物学7。ゼブラフィッシュは、比較的簡単なケア、ラージ クラッチ サイズ卵、扱いやすい遺伝学、簡単な遺伝子、透明な外部萌芽期の開発、それらの生体内イメージング5,6の優れたシステムを作るを提供します。既に現在の突然変異体の魚行の大規模なソースと完全に配列されたゲノム、ゼブラフィッシュは科学的発見の比較的無制限の範囲を提供します。
生体内でリアルタイム電気細胞の活性を調べるためには、私たちはゼブラフィッシュ モデル システムと ASAP1 の活用します。本稿では、メダカ Tol2 トランスポゾン遺伝子導入を用いたゼブラフィッシュ ゲノムに電圧蛍光バイオ センサー ASAP1 を組み込む方法について説明し、萌芽期の開発、魚幼虫の動きの間にそしてライブ腫瘍細胞の電気活動を可視化します。.
Protocol
Representative Results
Discussion
萌芽期の開発および人間の病気中の細胞およびティッシュ レベル電気活動が長い時間前に発見されたが生体内での動的電気的変化とその生物学的役割まだ主は不明のまま。電気的変化を定量化を視覚化して主要な課題の 1 つです。パッチ ・ クランプの技術は単一のセルを追跡するため、休憩が、彼らは多くの細胞で構成されているために、脊椎動物の胚への応用は限られました。現?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究がによって国立科学研究所の一般医療賞数 R35GM124913、パデュー大学 PI4D インセンティブ プログラム、および PVM 内部競争の下で健康の国民の協会のサポートされていた基本的な研究資金プログラムです。内容は著者の責任と資金調達エージェントの公式見解を必ずしも表さない。メダカ Tol2 構築、ASAP1 構造体のマイケル ・ リンありがとう川上浩一、 ubiプロモーターのレナード ・ ゾンを Addgene を構築します。
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
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