التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام
Summary
هنا، نحن إظهار عملية إنشاء خط جهد كهربائي خلوية الزرد مراسل لتصور التنمية الجنينية، والحركة، والأسماك ورم الخلايا في الجسم الحي.
Abstract
تنوعها والإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية، تلعب أدواراً هامة في إشارات العمليات منفعل من الخلايا العصبية والعضلات والعديد من العمليات البيولوجية الأخرى، مثل الجنينية الزخرفة التنموية. ومع ذلك، هناك حاجة لرصد النشاط الكهربائي في فيفو في embryogenesis الفقاريات. التقدم المحرز مؤشرات الجهد الفلورسنت المشفرة جينياً (جيفيس) مكنت لتوفير حل لمواجهة هذا التحدي. هنا، نحن تصف كيفية إنشاء الزرد مؤشر جهد المحورة وراثيا استخدام مؤشر الجهد المعمول، ASAP1 (تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1)، على سبيل مثال. يو بي أي، اختيرت كيت Tol2 ومروج الزرد في كل مكان، في هذه الدراسة. ونحن أيضا شرح عمليات استنساخ بوابة الموقع، Tol2 الزرد المستندة إلى ينقول ترانسجينيسيس، وعملية التصوير للأورام الأجنة والأسماك الأسماك في مرحلة مبكرة باستخدام المجاهر العادية ابيفلوريسسينت. استخدام هذا الخط الأسماك، وجدنا أن هناك تغيرات الجهد الكهربائي الخلوية أثناء embryogenesis الزرد، وحركة الأسماك اليرقات. وعلاوة على ذلك، فقد لوحظ أن ورم الخلايا كانت عموما الاستقطاب في أورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة الزرد قليلة، مقارنة بالانسجة الطبيعية المحيطة بها.
Introduction
ويشير تستخرجها للإشارات الكهربائية الذاتية بوساطة قنوات أيون والمضخات الموجودة على غشاء الخلية1. تبادل أيونى عبر الغشاء الخلوي، وإلى جانب التغييرات الحالية والمحتملة الكهربائية، ضرورية لإشارات عمليات خلايا العصبية والعضلات منفعل. وباﻹضافة إلى ذلك، تستخرجها والتدرجات وأيون لها مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية الهامة الأخرى بما في ذلك تخزين الطاقة والنقل المستقلب والحيوي،. إشارات bioelectrical اكتشفت أيضا كمنظم لتشكيل نمط الجنينية، مثل هيئة المحاور، ودورة الخلية، والخلية التمايز1. وبالتالي، من الأهمية بمكان لفهم العديد من الأمراض الخلقية البشرية التي تنجم عن سوء تنظيم هذا النوع من الإشارات. على الرغم من أن المشبك التصحيح قد استخدمت على نطاق واسع لتسجيل الخلايا المفردة، أنها لا تزال بعيدة عن المثالية للرصد المتزامن لخلايا متعددة أثناء التطور الجنيني في فيفو. وعلاوة على ذلك، الجهد جزيئات صغيرة حساسة أيضا ليست مثالية للتطبيقات في فيفو نظراً لخصائصها، والحساسيات، والسمية.
إنشاء مجموعة متنوعة من وراثيا ترميز الجهد الفلورسنت المؤشرات (جيفيس) يوفر إليه جديدة للتغلب على هذه المشكلة، ويسمح للتطبيقات سهلة لدراسة التطور الجنيني، على الرغم من أنها كانت مخصصة أصلاً لرصد العصبية الخلايا2،3. واحد جيفيس المتاحة حاليا هو تسارع جهاز استشعار لإمكانات العمل 1 (ASAP1)4. وهو يتألف من حلقة خارج الخلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد الجهد الفوسفاتيز الحساسة وبروتين فلوري أخضر دائري مبدل. ولذلك، يسمح ASAP1 التصور للتغيرات المحتملة الكهربائية الخلوية (الاستقطاب: أخضر ساطع؛ depolarization: أخضر داكن). ASAP1 2 مللي ثانية وإيقاف حركية، ويمكن تعقب التغيير المحتمل سوبثريشولد4. وبالتالي، تتيح هذه الأداة الوراثية لمستوى جديد من الكفاءة في رصد الاحتمالات في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. زيادة فهم أدوار تستخرجها في التطور الجنيني وكثير من الأمراض البشرية، مثل السرطان، سوف ضوءا جديداً على الآليات الكامنة، التي حاسمة بالنسبة للوقاية والعلاج من الأمراض.
ثبت الزرد نموذج حيوان قوية لدراسة علم الأحياء التنموي والأمراض البشرية بما في ذلك السرطان5،6. تتبادل الجينات أورثولوجوس 70% مع البشر، ولديهم بيولوجيا الفقاريات مماثلة7. الزرد توفير الرعاية سهلة نسبيا، وحجم مخلب كبير من البيض وتتبعها الوراثة، ترانسجينيسيس سهلة وشفافة من التنمية الجنينية الخارجية، مما يجعلها نظام متفوقة في فيفو التصوير5،6. مصدر كبير للأسماك متحولة خطوط موجودة بالفعل وجينوم الكامل متتابع، ستوفر الزرد نطاق محدود نسبيا من الاكتشافات العلمية.
للتحقيق في فيفو في الوقت الحقيقي النشاط الكهربائي للخلايا، علينا الاستفادة من النظام النموذجي الزرد و ASAP1. في هذه الورقة، تصف كيفية إدماج biosensor الجهد نيون ASAP1 في الجينوم الزرد استخدام Tol2 ينقول ترانسجينيسيس، وتصور النشاط الكهربائي الخلوية أثناء التطور الجنيني، حركة الأسماك اليرقات، وفي ورم لايف .
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تم اكتشاف الخلايا والأنسجة ومستوى الأنشطة الكهربائية أثناء التطور الجنيني والأمراض البشرية منذ زمن طويل، في فيفو الكهربائية التغيرات الدينامية ودورها البيولوجي لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. أحد التحديات الرئيسية هو تصور وتحديد التغييرات الكهربائية. التكنولوجيا ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد أعمال البحث التي ذكرت في هذا المنشور بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم R35GM124913 وبرنامج الحوافز PI4D جامعة بوردو، والتنافسية الداخلية PVM برنامج صناديق الأبحاث الأساسية. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لعملاء التمويل. ونحن نشكر كويشي كاواكامي لبناء Tol2، مايكل لين لبناء ASAP1، وتشييد زون ليونارد للمروج يو بي أي عن طريق أدجيني.
Materials
| 14mL cell culture tubes | VWR | 60818-725 | E.Coli culture |
| Agarose electrophoresis tank | Thermo Scientific | Owl B2 | DNA eletrophoresis |
| Agarose RA | Amresco | N605-500G | For making the injection gels |
| Attb1-ASAP1-F primer | IDT DNA | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGAGACGACTGTGAGGTATGAACA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Attb2-ASAP1-R primer | IDT DNA | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAGGTTACCACTTCAAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA | ASAP1 coding region amplification for subcloning |
| Bright field dissection scope | Nikon | SMZ 745 | Dechorionation, microinjection, mounting |
| Color camera | Zeiss | AxioCam MRc | Fish embryo image recording |
| Concave slide | VWR | 48336-001 | For holding fish embryos during imaging process |
| Disposable transfer pipette 3.4 ml | Thermo Scientific | 13-711-9AM | Fish embryos and water transfer |
| Endonuclease enzyme, Not I | NEB | R0189L | For linearizing plasmid DNA |
| Epifuorescent compound scope | Zeiss | Axio Imager.A2 | Fish embryo imaging |
| Epifuorescent stereo dissection scope | Zeiss | Stereo Discovery.V12 | Fish embryo imaging |
| Fluorescent light source | Lumen dynamics | X-cite seris 120 | Light source for fluorescence microscopes |
| Forceps #5 | WPI | 500342 | Dechorionation and needle breaking |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Scientific | 11789020 | Gateway BP recombination cloning |
| Gateway LR Clonase II Plus enzyme | Thermo Scientific | 12538120 | Gateway LR recombination cloning |
| Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | DNA gel purification |
| Loading tip | Eppendorf | 930001007 | For loading injection solution into capilary needles |
| Methylcellulose (1600cPs) | Alfa Aesar | 43146 | Fish embryo mounting |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Suppresses fungal outbreaks in Petri dishes |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To prepare agaorse mold tray for holding fish embryos during injection |
| Microinjector | WPI | Pneumatic Picopump PV820 | Microinjection injector |
| Micro-manipulator | WPI | Microinjector mm33 rechts | Microinjection operation |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | For preparing capillary needle |
| Mineral oil | Amresco | J217-500ml | For calibrating injection volume |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Thermo Scientific | AM1340 | mRNA in vitro transcription |
| Monocolor camera | Zeiss | AxioCam MRm | Fish embryo image recording |
| Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4020 | Prepare small amount of plasmid DNA |
| Plastic Petri dishes | VWR | 25384-088 | For holding fish or fish embryos during imaging process |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | mRNA cleaning after in vitro transcription |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | For measuring DNA and RNA concentrations |
| Stage Micrometer | Am Scope | MR100 | Microinjection volume calibration |
| Thermocycler | Bio-Rad | T100 | DNA amplification for gene cloning |
| Thin wall glass capillaries | WPI | TW100F-4 | Raw glass for making cappilary needle |
| Tol2-exL1 primer | IDT DNA | GCACAACACCAGAAATGCCCTC | Tol2 excise assay |
| Tol2-exR primer | IDT DNA | ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG | Tol2 excise assay |
| TOP10 Chemically Competent E. coli | Thermo Scientific | C404006 | Used for transformation during gene cloning |
| Tricaine mesylate | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing fish or fish embryos |
| UV trans-illuminator 302nm | UVP | M-20V | DNA visualization |
| Water bath | Thermo Scientific | 2853 | For transformation process of gene cloning |
References
- Levin, M. Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).
- Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).
- Inagaki, S., Nagai, T. Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).
- St-Pierre, F., et al. High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor. Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. , (2013).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Mosimann, C., et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development. 138 (1), 169-177 (2011).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Ordovas, J. M. Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis. Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).
- Downey, N. Extraction of DNA from agarose gels. Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2012).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), (2007).
- Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio. Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Amsterdam, A., et al. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish. PLoS Biology. 2 (5), E139 (2004).
- Lai, K., et al. Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish. Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Zhang, G., et al. Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery. PLoS Genetics. 9 (8), e1003734 (2013).
- Zhang, G., et al. Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).
- Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. Potassium channels in cell cycle and cell proliferation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094 (2014).
- Yang, H. H., et al. Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo. Cell. 166 (1), 245-257 (2016).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
- Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).
