Bu iletişim kuralı, prostat kanseri hücreleri, sonraki kastrasyon içi Prostatik enjeksiyon göstermek için hedeftir. Orthotopic önceden klinik androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri hastalığı klinik tümör microenvironment ve immün bir ana bilgisayar bağlamında incelemek için kritik modellerdir.
Orthotopic tümör modelleme önceden klinik prostat kanseri araştırmaları için değerli bir araç olarak her ikisi de subkutan üzerinde birden çok avantajları vardır ve transgenik genetik mühendisliğiyle fare modelleri içindir. Subkutan tümörler orthotopic tümörler daha klinik olarak doğru damarlara, tümör microenvironment ve birden çok terapiler yanıtlarını içerir. Buna ek olarak genetiği fare modelleri, modelleri daha düşük maliyetle gerçekleştirilebilir ve içinde daha az zaman, son derece karmaşık ve türdeş olmayan fare veya insan kanser hücre hatları, kullanımı dahil orthotopic yerine bu genetik değişiklikler, bu hücre tek ve satırları genetik olarak değiştirilebilir, hızlı görüntüleme ajanlar gibi. Burada, cerrahi olarak luciferase ve mCherry ifade fare prostat kanseri hücre kültürünü fareler ön prostat LOB enjekte için bir protokol mevcut. Bu fareler non-invaziv izlenen vivo içinde ve daha fazla tümör hacim, ağırlık, fare hayatta kalma ve bağışıklık infiltrasyon için analiz orthotopic tümör geliştirdi. Ayrıca, orthotopic tümörü taşıyan fareler cerrahi olarak, hadım anında tümör regresyon ve sonraki yineleme için lider, hadım etme dayanıklı prostat kanseri temsil eden. Teknik beceri için bu yordamı gerçekleştirmek için gerekli olmakla birlikte, bu syngeneic orthotopic hem androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri büyük kullanım alanındaki tüm araştırmacılar için modeldir.
Prostat kanseri (161,360 erkek) en yüksek insidansı olması ve 20171‘ üçüncü en erkek kanser ölüm (84,590 erkek) neden tahmin edilmektedir. Tanı, üzerine prostat tümör androjen bağımlıdır ve cerrahi prostatektomi, radyasyon tedavisi ve/veya androjen yoksunluk tedavisi (ADT) tarafından tedavi edilir, henüz her tedavi birden çok önemli morbiditeler ve komplikasyonlar2 ile ilişkilidir , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ADT sonra tümör regresyon rağmen neredeyse tüm tümörler kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) olarak tekrarlayabilir. Bu aşamada, docetaxel, Sipuleucel-T immünoterapi ve anti-androjen küçük moleküllerin enzalutamide ve abiraterone Onaylanmış tedaviler bulunmaktadır, henüz hiçbir bireysel tedavi bir hayatta kalma yarar 5.2 ay11, ‘in confers 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Gelişmiş tedavi seçenekleri ve yönetiminin morbiditeler hangi en iyi önceden klinik hastalık için modelleme önemlidir, bu nedenle, erkek prostat kanseri her aşamasında gerekir.
Doğru prosedür ile prostat kanseri hücre hatları cerrahi olarak her iki syngeneic veya xenogeneic orthotopic tümör gelişimine lider fare prostat içine telkin. Orthotopic tümör modelleme bir klinik olarak temsilcisi tümör microenvironment (TME) ile tümör gelişimi için izin tüm tümör biyolojisi ve uyuşturucu Kalkınma Araştırmaları için idealdir. Önceki çalışmalar subkutan (SC) tümör Diferansiyel ve daha az klinik olarak doğru yanıt-e doğru anti-anjiogenik tedavi18,19önde gelen bir değişmiş tümör damarlara sahip göstermiştir. Ayrıca, birden fazla çalışmalar s.c. veya orthotopically, ikincisi olan en iyi temsil ne insanda görülür olup olmadığını bağlı olarak aynı hücre kültürünü tedavisinde birden çok chemotherapeutics artan veya azalan etkinliğinin yönetilen gözlemledim Kanser20,21,22. Ayrıca, sadece bir orthotopic modeli kolon kanseri, ama değil SC modeli, tümör doğru degradative enzimler metastaz23ikna etmek gerekli üretmek. Son olarak, immunotherapies kanser tedavisi ön planda ortaya çıkmaya devam etmek ve özellikle prostat kanseri24,25, doğru TME syngeneic önceden klinik modeller için önemli yararı sağlamak henüz ellerinde ve immün ana drenaj lenf düğümleri kritik öneme sahiptir.
Tümör ücreti dayalı bu tutarsız bulgular sorumlu birçok faktör vardır. Farklı bir TME ile kanser hücrelerinin farklı doku özgü endotel için sunulur ve anjiogenezi, böylece tümör geliştirme26,27etkileyen değişmiş. Doğru TME Orthotopic tümörlerle klinik ilaç dağıtım, hipoksik koşulları ve anti-anjiogenik tedavi28değerlendirilmesi için izin verir. Genetiği modelleri (taşlar) doğru bir zaman onlar uzun gerektirir içerirken kez ıslahı, yüksek maliyet ve are için sık sık dayalı manipülasyonlar elendikçe veya klinik düzeyleri overexpressed tek veya birkaç gen. Buna ek olarak, orthotopic tümör, insan tümörleri gibi kullanılan insan veya fare prostat kanseri hücre hatları genetik olarak çok daha karmaşık tek hücreleri içinde ve heterojenlik hücreleri29,30arası görüntüleniyor. Ayrıca taşlar, orthotopic kanser hücre satır görüntüleme yöntemleri ifade etmek için tasarlanmış veya artan veya azalan faiz ve vitro ve in vivo deneysel sonuçlar diğer moleküllerin düzeyde doğrudan karşılaştırılabilir. Orthotopic tümörler de birincil hasta kaynaklı hücrelerden oluşmuş olabilir. Burada, orthotopic androjen bağımlı tümörler oluşturur ve sonra hadım etme, orthotopic CRPC yinelenmesini prostat kanseri hücre içi Prostatik enjeksiyonları gerçekleştirmek için metodoloji raporu.
Bu el yazması cerrahi içi prostat kanseri hücre enjeksiyonları gerçekleştirmek için protokol anahat. Androjen bağımlı ve MYC –overexpressing kullanılan (MYC overexpression görülür kadar insan prostat kanseri39yüzde 80-90) fare prostat kanseri hücre kültürünü, Myc-CaP, başlangıçta Hi-Myc fare32 kişiden izole ,33. Bu hücre kültürünü stabil luciferase ve mCherry, non-invaziv vivo içinde Kollarındaki ve floresan tümör görüntüleme için sırasıyla ifade etmek için transduced. Ayrıca, cerrahi kastrasyon de androjen bağımlı tümör geliştirme, tümör regresyon ve sonraki yineleme sonra gerçekleştirildi. Bu nedenle, biz orthotopic androjen bağımlı prostat kanseri ve CRPC bir immün ana bilgisyarına modellemek için ayrıntıları sağlar.
Myc-CaP hücreleri farelerin prostat ön LOB enjekte edildi. Fare prostat anterior, ventral ve dorsolateral prostat lobları oluşur ve çevre bölge, geçiş bölgesi ve orta bölge içinde tek LOB40insan prostat oluşur. Önceki çalışmalar anatomik ve histolojik olarak dorsolateral fare LOB insan periferik için karşılaştırıldığında var iken bölge, prostat kanserleri41çoğunluğu ve anterior fare LOB insan Merkez Bölge42, 43, daha son ve kapsamlı analiz ön LOB ve dorsolateral LOB yakından ilgili gen ifade desenleri, ventral LOB ile karşılaştırıldığında görüntüler göstermiştir. 44 daha fazla, prostat kanseri geliştirme taşlar40ön lobunda gözlenmiştir, ve, içi Prostatik yordamı için ön LOB kanser hücre çözümü en az ele verir şekilde gerekli hacmi enjeksiyon sağlar ve değişkenlik.
SC ve transgenik GEM kullanarak kanser modelleri var birden çok kusurları ve sınırlamalar. Bir yapay TME yetiştirilen SC tümör chemotherapies, aksine her iki orthotopic tümörler aynı hücre satırlarından ve insan hastalık20,21,22farklı yanıt var. Bu onların fark yanıt-e doğru anti-anjiogenik tedavi18,19tarafından örneği olarak SC tümörlerin değişmiş damarlara nedeniyle olabilir. Aksine, orthotopic tümör uygun TME, drenaj lenf düğümleri ve damarlara ile geliştirmek ve böylece de tümör İmmünoloji ve yanıt-e doğru immunotherapies analizi için izin fare hücre hatları ile gerçekleştirilebilir.
Transgenik taşlar geliştirmek tümörler uygun TME immün bir ev sahibi ile henüz bu modeller genellikle insan kanser tümörleri ile tek veya birkaç genetik değişiklikler29geliştirerek aşırı basitleştirmek. Myc-CaP ve diğer prostat kanseri hücre satırları bir analizini onlar kadar büyük somatik kopya numarası değişiklikler ve Hi-Myc fareler ve diğer taşlar türetilmiş29hangi olduklarını tümörler daha kromozomal değişiklikler içerdiği ortaya koydu. Ayrıca, taşlar artan maliyet ve zaman deneyler yeterli güç gerçekleştirmek için üreme fareler için gerekli tarafından sınırlıdır. Orthotopic tümör modelleme bu sınırlamalar üstesinden gelebilir. İnsan ve fare prostat kanseri hücre hatları genetik değişiklikler insan hastalık29için ilgili birçok içerir ve insan kanser gibi da tek tek hücreler30arası büyük heterojenlik gösterir. Orthotopic fare syngeneic tümör immünolojik analizleri için izin orthotopic insan xenogeneic tümörler tedavi insan hücreleri üzerinde analizlerini sağlar. Son olarak, aksine taşlar, enjeksiyon, kollarındaki veya floresan molekülleri Imaging ifade için tümör büyüme, izlemek için izin veren tümör yükünü deneysel grupları arasında normalize önce satır olarak hücre ile yanıt tedavi ve için izlemek tümör regresyon ve CRPC yineleme cerrahi kastrasyon sonra izleyin.
Bu protokol kritik adımlar bulma ve seminal vezikül ve ekli ön prostat LOB diğer dokulara zarar veya seminal vezikül, hücre 30 µL başarılı bir prostat içi enjeksiyon gerçekleştirme Delme olmadan dünyanızı içerir süspansiyon kaçağı ve düzgün karın boyunca sigara orthotopic tümör gelişimini önlemek için herhangi bir sızıntı toplama olmadan. Intra-prostat iğne büyük sınırlandırılması tümör değişkenlik fareler arasında en aza indirmek için gerekli teknik beceri ulaşmak. Bu cerrahi kastrasyon değişken eklendi vardır CRPC modelleme için özellikle önemlidir. İki büyük hayatta kalma ameliyat geçirmiş gibi içi-prostatically enjekte ve koyun fareler de yakından kurtarma ve istenmeyen olaylar için izlenmesi gerekir. Başka bir sınırlama içi Prostatik her enjeksiyon zamanı. Bu azaltılabilir geçerli fare dikmiş gibi için 20 dk gibi düşük ve cerrah asistan sonraki fare hazırlayabilirsiniz. Son olarak, orthotopic Myc-CaP tümörler hızlı birincil tümör nedeniyle yaklaşık 46 gün (ve 35 gün kadar erken) hayatta kalma son noktana ulaşmak tümörler kitle büyüyen, saldırgandır. Daha yavaş tümör geliştirme veya uzun süreli tedavi gerektiren çalışmalar ampirik olarak ilk enjeksiyon hücre sayısı ve tedavi rejimi için optimize edilmelidir. SC tümörler ve mücevher sınırlamalar, aksine tüm yukarıdaki sınırlama orthotopic tümör modelinin üstesinden gelebilir ve iletişim kuralı ek değişiklikler deneysel bireysel ihtiyaçlarına göre yapılabilir.
Orthotopic tümör modeli vitrokullanımı içerir-işlenmiş hücreleri, bu hücreler çalışma gereksinimlerine bağlı olarak değiştirilebilir. Burada, stabil luciferase ve in vivo tümör izlemek için mCherry ifade etmek için bu hücreleri değiştiren. Ayrıca Tümör baskılayıcı PTENorthotopic tümörler (incelemede el yazması) olarak daha hızlı büyür bir daha agresif, klinik hücre satırı oluşturmak için bir CRISPR-Cas9 nakavt gerçekleştirdiniz. Orthotopic tümör modeli, hem androjen bağımlı prostat kanseri ve CRPC ve görüntüleme yöntemleri veya select genler, köşenize veya overexpress ifade etmek için potansiyel çalışma yeteneği avantajları ile bu iletişim kuralı için değerli bir kaynak olarak hizmet Prostat kanseri araştırma.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser Ulusal Sağlık hibe Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (ncı R01 CA167966, ncı R01 CA123484 ncı P50 CA180995) ve Jonathan Anker (ncı F30 CA203472) Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |