本协议的目的是证明前列腺癌细胞内注射, 随后阉割。在临床相关的肿瘤微环境和免疫宿主的背景下, 应用雄激素依赖性和抗去势前列腺癌的原位前模型是研究该病的关键。
原位肿瘤模型是临床前前列腺癌研究的重要工具, 因为它在皮下和转基因小鼠模型中具有多种优势。与皮下肿瘤不同, 原位肿瘤包含更精确的临床血管、肿瘤微环境以及对多种疗法的反应。与基因工程鼠模型相比, 原位模型可以以较低的成本进行, 在更短的时间内, 涉及使用高度复杂和异构的老鼠或人类癌细胞系, 而不是单一的基因改变, 这些细胞线可以进行基因修饰, 比如表达成像剂。在这里, 我们提出了一个协议, 以外科注射荧光素酶-和 mCherry 表达小鼠前列腺癌细胞系到前前列腺叶。这些小鼠开发的原位肿瘤是无创监测的体内, 并进一步分析肿瘤体积, 体重, 小鼠生存和免疫浸润。此外, 原位瘤小鼠被手术阉割, 导致即刻肿瘤回归和随后复发, 代表去势抗前列腺癌。虽然需要技术技能来执行这一程序, 这种自体的原位模型的雄激素依赖性和去势抗前列腺癌是非常有用的所有调查员在该领域。
据估计, 前列腺癌发病率最高 (161360 人), 并导致第三位男性癌症死亡 (84590 人) 在 2017年1。诊断时, 前列腺肿瘤是雄激素依赖性的, 并通过手术前列腺切除术、放疗和/或雄激素剥夺治疗 (ADT) 治疗, 但每种治疗都与多种主要疾病和并发症有关2,3,4,5,6,7,8,9,10. 尽管 ADT 后肿瘤消退, 几乎所有的肿瘤复发的抗去势前列腺癌 (CRPC)。在这个阶段, 批准的治疗包括多西紫杉醇, Sipuleucel 免疫疗法和抗雄激素小分子 enzalutamide 和阿比特龙, 但没有单独的治疗提供5.2 月以上的生存好处11,12,13,14,15,16,17. 因此, 男性在前列腺癌的各个阶段都需要改进的治疗方案和疾病的管理, 这是最好的临床前病建模是至关重要的。
通过正确的程序, 前列腺癌细胞系可以被外科灌输到小鼠前列腺, 导致自体或异种原位肿瘤的发展。原位肿瘤建模是所有肿瘤生物学和药物开发研究的理想选择, 它允许肿瘤的发展具有临床代表性的肿瘤微环境。先前的研究表明, 皮下 (南卡罗来纳州) 肿瘤有一个改变的肿瘤血管, 导致差异和较少的临床准确反应的抗血管生成疗法18,19。此外, 多项研究观察到, 在治疗同一细胞系时, 多化疗的疗效有所增加或减少, 这取决于它是被管理的是南卡罗来纳州还是原位, 后者最能代表人类所看到的癌症20,21,22。此外, 只有在结肠癌的原位模型, 但不是在南卡罗来纳州模型, 肿瘤产生了正确的降解酶诱导转移的23。最后, 随着免疫疗法继续出现在癌症治疗的前沿, 特别是因为他们还没有为前列腺癌提供显著的好处 24, 25, 自体的前临床模型, 准确的和在免疫的宿主中引流淋巴结是至关重要的。
有许多因素导致这些不一致的结果, 基于肿瘤部位。在不同的情况下, 癌细胞暴露于不同的组织特异内皮细胞和改变血管生成, 从而影响肿瘤的发展26,27。具有正确的原位肿瘤可用于临床相关的药物传递、缺氧条件和抗血管生成疗法的评价28。虽然基因工程模型 (宝石) 确实包含了准确的时间, 他们需要很长时期的育种, 高成本, 并往往基于操作的单一或少量的基因敲出或抗原超出临床相关水平。相比之下, 在原位肿瘤中使用的人或小鼠前列腺癌细胞系, 如人类肿瘤, 在单个细胞内和显示细胞间的异质性方面更具遗传学复杂性29,30。也不像宝石, 原位癌细胞系可以被设计来表达成像方式或增加或减少其他感兴趣的分子水平, 和体外和体内实验结果可以直接比较。原位肿瘤也可以从原发性患者衍生细胞中形成。在这里, 我们报告的方法, 执行前列腺内注射前列腺癌细胞, 形成原位雄激素依赖性肿瘤, 并在阉割后复发, 作为原位 CRPC。
在这篇手稿中, 我们概述了执行前列腺癌细胞内注射手术的协议。我们利用雄激素依赖性和 c-myc overexpressing (c-myc 多表达被认为高达80-90% 的人前列腺癌39) 小鼠前列腺癌细胞系, c-myc-CaP, 最初被隔离的高 c-myc 鼠标32 ,33。该细胞系稳定转基因表达荧光素酶和 mCherry, 为非侵入性的体内生物发光和荧光肿瘤成像, 分别。此外, 在雄激素依赖性肿瘤发展后也进行了手术去势, 导致肿瘤的回归和复发。因此, 我们提供的细节, 以模型的雄激素依赖性前列腺癌和 CRPC 在免疫宿主。
将 c-myc 帽细胞注入小鼠前前列腺叶。小鼠前列腺包括前, 腹, 和侧前列腺裂片, 和人前列腺由一个外围区域, 过渡区, 和中央区在一个单一的裂片40。虽然以前的研究有解剖和组织学比较侧小鼠裂片到人的外围区域, 大多数前列腺癌的站点41, 并且前鼠裂片到人的中央区域42, 43, 最近和综合分析表明, 与腹叶相比, 前叶和侧叶显示密切相关的基因表达模式。44此外, 在宝石40的前叶中观察到前列腺癌的发展情况, 对于前列腺内的手术, 前叶允许注入必要体积的癌细胞溶液, 最小的渗漏和变异性。
使用南卡罗来纳州和转基因宝石癌模型有多种缺陷和局限性。在人工手术中生长的南卡罗来纳州肿瘤对化疗有不同的反应, 与同种细胞系和人类疾病的原位肿瘤相比,20,21,22。这可能是由于该肿瘤的血管改变, 如其对抗血管生成疗法的差异反应的例子18,19。相反, 原位肿瘤的发展与适当的, 引流淋巴结, 和血管, 可以进行小鼠细胞系, 从而也允许分析肿瘤免疫学和反应免疫疗法。
转基因宝石在免疫宿主中发育适当的肿瘤, 然而这些模型通常通过发展单一或少量基因改变的肿瘤来简单化人类癌症29。对 c-myc 和其他前列腺癌细胞系的分析显示, 它们包含的体细胞拷贝数的改变和染色体的改变比来自于 c-myc 的小鼠和其他宝石的肿瘤更大, 而它们的来源为29。此外, 宝石是有限的增加成本和时间所需的小鼠育种进行足够的权力实验。原位肿瘤模型可以克服这些局限性。人和小鼠前列腺癌细胞系包含许多与人类疾病相关的基因改变29, 而且像人类癌症一样, 在各个细胞之间也显示出很大的异质性30。原位小鼠自体肿瘤可以进行免疫学分析, 而原位人类异种肿瘤则允许对人类细胞的治疗进行分析。最后, 与宝石不同的是, 细胞线可以在注射前进行修改, 允许表达发光或荧光成像分子来监测肿瘤的生长, 使实验组中的肿瘤负担正常化, 监测对治疗的反应, 并术后应遵循肿瘤回归和 CRPC 复发。
该协议的关键步骤包括定位和外部的精囊和附加前前列腺叶不损害其他组织或穿刺精囊, 执行成功的前列腺内注射30µL 细胞悬浮无渗漏, 适当收集任何渗漏物, 防止整个腹部的非原位肿瘤发展。前列腺内注射的主要局限性是达到最小化小鼠肿瘤变异性所需的技术技能。这是特别重要的建模 CRPC, 这是增加的变量的手术阉割。prostatically 内注射和去势小鼠也必须密切跟踪恢复和不良事件, 因为他们已经经历了两个主要的生存手术。另一个限制是前列腺内注射的时间。这可以减少到最低20分钟, 和外科医生助理可以准备下一只老鼠, 因为目前的鼠标正在缝合。最后, 原位 c-myc 帽肿瘤是侵袭性的, 快速生长的肿瘤, 达到生存终点约46天 (和早在35天) 由于原发肿瘤肿块。需要较慢的肿瘤发展或长期治疗的研究应进行经验优化的初始注射细胞计数和治疗方案。与该肿瘤和宝石的局限性相比, 原位肿瘤模型的所有上述局限性都可以克服, 并且可以根据个体的实验需要对该协议进行额外的修改。
由于原位肿瘤模型涉及使用体外处理细胞, 这些细胞可以根据研究的需要进行修改。在这里, 我们修改这些细胞, 以稳定地表达荧光素酶和 mCherry 为体内肿瘤监测。我们还进行了 CRISPR-Cas9 的肿瘤抑制因子PTEN, 以产生一个更积极, 临床相关的细胞系, 增长更快的原位肿瘤 (手稿在审查)。由于原位肿瘤模型的优点, 研究雄激素依赖性前列腺癌和 CRPC 的能力, 以及表达成像方式或击倒或过度表达 tshr 选择基因的潜力, 这个协议作为一个宝贵的资源, 为所有前列腺癌的研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了国家卫生研究所的支持, Praveen Thumbikat (NIDDK R01 DK094898), Sarki Abdulkadir (美国癌症 R01 CA167966, R01 CA123484, P50 CA180995) 和乔纳森安克 (美国的 F30 CA203472)。
Myc-CaP cell line | ATCC | CRL-3255 | Verify as mycoplasma-free before use |
Micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5910 | |
Graege forceps | Roboz | RS-5135 | |
Graefe tissue forceps | Roboz | RS-5150 | |
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters | FST | 12002-12 | |
50 µL Syringe 705 RN SYR | Hamilton | 7637-01 | Sterilize by ethylene oxide gas |
28-gauge Needles Small Hub RN | Hamilton | 7803-02 | Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas |
RPMI | Gibco | 18875-093 | |
FBS | Gibco | 10437-028 | |
Pencillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free | Corning | 356237 | Thaw on ice in 4°C overnight before use |
Isoflurane | Henry Schein | 11695-0500-2 | Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM) |
26 5/8-gauge syringe | BD | 309597 | For meloxicam and buprenorphine injections |
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL | 12496-0757-5 | Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM | |
Ophthalmic ointment lubrication | Akron | 17478-162-35 | |
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%) | Purdue Products | 67618-151-16 | |
Sterile non-adhering pads | Moore Medical | 10775 | |
Sterile alcohol wipes | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Surgical microscope Stemi DV4 | Zeiss | ||
Sterile polyester tipped applicators | Puritan | 25-806 1PD | |
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | J493G | |
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures | eSutures | 699H | |
Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Sterile saline 0.9% sodium chloride | Hospira | 0409-4888-02 | |
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL | Henry Schein | 11695-6925-1 | Acquired from Northwestern University CCM |
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate | Goldbio | LUCNA | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer | ||
Cauery surgical pen | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
CD3ε antibody (clone 2GV6) | Ventana | 790-4341 | |
Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 | |
Androgen receptor antibody | Thermo Scientific | RB-9030-P1 | 1:500 staining dilution |
Synaptophysin antibody (clone Z66) | Life Technologies | 18-0130 | 1:200 staining dilution |