العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية
Summary
ويصف هذا البلاغ موريني نماذج لأغراض تجريبية ومنهجيات للعزلة وثقافة البلاعم السنخية من البشر.
Abstract
البلاعم السنخية هي الضامة الميؤوس من شفائهم المتباينة، والمقيم في الرئة الأصلية قبل الولادة. البلاعم السنخية فريدة من نوعها في حياتها الطويلة ودورها الهام في تنمية الرئة ووظيفة، فضلا عن ردودها المترجمة بالرئة بالعدوى والالتهابات. وحتى الآن، لا توجد طريقة موحدة لتحديد الهوية والعزلة، والتعامل مع البلاعم السنخية من البشر والفئران موجود. مثل هذا أسلوب ضروري لإجراء دراسات عن هذه الخلايا المناعية الفطرية الهامة في مختلف البيئات التجريبية. الأسلوب الموصوفة هنا، الذي يمكن اعتماده بسهولة بأي مختبر، نهج مبسطة لحصاد البلاعم السنخية من سائل الغسل للفيسيولوجيا أو من أنسجة الرئة والحفاظ عليها في المختبر. لأن السنخية الضامة يحدث أساسا كخلايا ملتصقة في الحويصلات الهوائية، هذا الأسلوب ينصب التركيز على إزاحة لهم قبل الحصاد، وتحديد الهوية. الرئة جهاز فاسكولاريزيد عالية، وتسكن مختلف أنواع الخلايا المنشأ النقوي واللمفاوية، والتفاعل، وتتأثر المكروية الرئة. باستخدام مجموعة علامات السطح الموصوفة هنا، الباحثين يمكن بسهولة وبشكل لا لبس فيه تمييز البلاعم السنخية من الكريات البيضاء الأخرى، وتنقية لهم طلبات المتلقين للمعلومات. الأسلوب الثقافة المتقدمة هنا يدعم كلا الإنسان والفأر البلاعم السنخية للنمو في المختبر ، ومتوافقة مع الدراسات الخلوية والجزيئية.
Introduction
المكروية الرئة نظام إيكولوجي فريد معقدة مع قناة الهواء تفصيلاً والمفرج. ويسافر الهواء المستنشق عن طريق القصبة الهوائية وفروع عديدة من القصبات والقصيبات قبل أن تصل إلى الحويصلات الهوائية، التي يحدث فيها تبادل الغازات الجوية الدم. نظراً للتفاعل المباشر مع الغلاف الجوي، يتطلب السطح التنفسي الحماية من الآثار الضارة المحتملة للجسيمات العالقة في الهواء والملوثات. عدد من الحواجز المادية والكيميائية والمناعية حماية الرئتين. جدير بالذكر أن نشر البالعات في السطح التنفسي يخدم نظام الدفاع السطر الأول هام. البلاعم السنخية (هيئة علماء المسلمين) نوع واحد من البالعات المقيم في الرئة، ويشكلون الغالبية العظمى من تجمع بلعم الرئة. وكما يوحي اسمها، هيئة علماء المسلمين هي أساسا مترجمة إلى التجويف السنخية وتحدث كخلايا لاطئة الذي عينة في الغلاف الجوي المحيط باستمرار والتواصل مع ظهارة السنخية1. في حالة مستقرة الرئتين، أكثر من 95 في المائة البالعات في الفضاء السنخية هي مقياس الدعم الكلي2، تشكيلها قد تغير بسبب الالتهاب أو العدوى أو التعرض المزمن للملوثات.
هيئة علماء المسلمين المشاركة في مجموعة واسعة من الوظائف التي قد تكون محلية إلى الرئتين و/أو ذات الأهمية الشاملة. على سبيل المثال، هيئة علماء المسلمين تعتبر أساسية في التنمية والأداء الأمثل للرئتين؛ المراقبة المناعية؛ وإزالة الحطام الخلوية والغازية المسببة للأمراض، واستنشاق الجسيمات3،،من45،،من67. استنفاد المستهدفة من هيئة علماء المسلمين المعروف أن تنال من إزالة فيروسات الجهاز التنفسي والبكتيريا4،8. وإلى جانب دورها البالعات والمدافعين عن السطر الأول من التوازن الرئوية، معروفة مقياس الدعم الكلي وظيفتها كما عرض مستضد الخلايا في استخلاص تي الخلية9من الحصانة، potentiating فعالية اللقاحات داخل الآنف10 و التأثير على المناعة الذاتية المقيدة-الرئة بعد زرع الرئة11،12. ارتبط نقص في وظيفة صباحا إلى بروتينوسيس السنخية الرئوية (PAP)، شرط الناتجة عن الطفرات الوراثية، خبيثة أو الإصابة التي يعوق إزالة التوتر السطحي الرئوي13،14. يجري الآن بحث زرع الكلي كنهج علاجية للعلاج من PAP 15،16.
مقياس الدعم الكلي المعروف أن تنشأ أثناء امبريوجينيسيس وأن تستمر في الرئتين طوال الحياة دون محلها تعميم الكريات البيضاء2،17. وعلى الرغم من دوران الساعة غير قابل للكشف في الرئتين التماثل الساكن، أبلغ مستويات متفاوتة من دوران صباحا في بعض الشروط السريرية بما في ذلك الإصابة بفيروس الإنفلونزا4، تشعيع ميلوابلاتيفي18، والتعرض إلى الذيفان في سن 19، وتبلغ من العمر20. يعتقد أن مقياس الدعم الكلي لتجديد ذاتيا عن طريق انتشار منخفضة الدرجة17،21، ولكن المطالبة ببعض الدراسات التي أجريت مؤخرا أن وحيدات يمكن أن تؤدي إلى عدد سكان من الرئة داخل الأوعية الضامة22،23 في إطار الظروف التجريبية، لكن الأداء الوظيفي لهذه الضامة الرئوية المحولة حديثا لم يتم تعريفها في أمراض الرئة. وعلاوة على ذلك، فهم عتبة التحفيز في سياق التنشيط صباحا منطقة يحتمل أن تكون مثيرة لاهتمام، والرئة محاولات للحفاظ على توازن بين الإشارات التحريضية والآلات إيمونوريجولاتوري.
التغييرات الفسيولوجية أو باثولوجي التي تؤدي إلى فقدان التنظيم المناعي مهمة تقييم في ظروف سريرية مختلفة (مثل التهابات الجهاز التنفسي وأمراض التهاب الرئة وأمراض الرئة تليفية). ومع ذلك، تزايد الاعتراف هيئة علماء المسلمين كمؤشرات أو حتى محددات الصحة الرئوية11،24. حاليا، لا تتوفر أية بروتوكولات موحدة للحصاد، وتميز، و/أو الحفاظ على هيئة علماء المسلمين من البشر ونماذج مورين الإكلينيكية. عدم وجود توافق في الآراء بشأن السلائف صباحا وتعمل، وعدم وجود منهجية مفصلة كان الحاجز الرئيسي في دور (أدوار) أتاح للساعة في الصحة الرئوية وأمراض. ويوفر البروتوكول التالي تحديد نهائي، والعزلة، و في المختبر استراتيجية الثقافة إلى حد كبير تحسين فهم السلوك صباحا، وتيسير الدراسات التشخيصية والعلاجية التي استهدفت صباحا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هيئة علماء المسلمين هي الضامة المقيم في الرئة الحية الطويلة التي ملء الرئتين تبدأ عند الولادة ودائمة على مدى طوال فترة الحياة26. تم الاعتراف بأدوارهن في7 وعلم الأمراض الرئوية علم وظائف الأعضاء12 وقدرتها على التنبؤ بالمناعة الذاتية الرئوية24<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر برندرغاست كلير للمساعدة في تحرير المخطوطة. دكن معتمد ببحث منح (#2095) من مؤسسة فلين ومعتمد TM من المنح المقدمة من “المعاهد الوطنية للصحة” (R01HL056643 و R01HL092514). دكن تطوير الأساليب وتصميم الدراسة وكتبت المخطوطة؛ أم ساعدت الدراسات الحيوانية وعينه سريرية المشتريات؛ SB ساعد تدفق سيتوميتريك تحليل وفرز الخلايا؛ TM الإشراف على الدراسات واستعرض المخطوطة.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
References
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
