Electrochemiluminescence анализов для человека островок аутоантител
Summary
Здесь мы представили методы для обнаружения аутоантител человека островок с помощью electrochemiluminescence (ЭСЛ) анализов. Протокол, используемый для прогнозирования диабета 1 типа, может быть расширена после выявления аутоантител для других аутоиммунных заболеваний.
Abstract
Выявлением островок аутоантител, связанные с сахарным диабетом 1 типа (T1D) ведет путь к проекту и сдерживания этого заболевания среди населения в целом. Роман пробирного ECL относится нерадиоактивных жидкой фазы для аутоантител островок с высокой чувствительностью и специфичностью, чем текущий «золото» стандартного радио привязки анализа (РБА). ECL анализов можно более точно определить начала presymptomatic T1D путем разграничения высокого риска, высокоспецифичных аутоантител от низкого риска, низкого сродства аутоантител, порожденных в РБАГ и обычных иммуноферментного анализа (ИФА ). Антигена протеина, используемые в этот assay ECL помечены сульфогруппу tag и биотин, соответственно. Калибровочных ECL аутоантител, использующий определенного антигена протеина потребностей шаг оптимизации, прежде чем он может использоваться для приложений Лаборатории. Этот шаг особенно важна при определении требований для сыворотки кислотных обработок, концентрации и соотношения двух различных антигенов, помечены сульфогруппу tag и биотин. Для выполнения анализа, сыворотки, пробы смешиваются с конъюгированных сульфогруппу тегов и биотинилированным захватить антиген белка в раствора фосфатного буфера (PBS), содержащая 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА). После этого Образцы инкубируют на ночь при 4 ° C. Тот же день, стрептавидина покрытием пластина подготовлен с буфером блокатор и инкубированы всю ночь при 4 ° C. На второй день мыть пластину стрептавидина и передачи сыворотки антиген смесь на плиту. Поместите пластины на пластину шейкер, установите его на низкой скорости и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Впоследствии пластины промывают снова, и читатель буфер добавляется. Пластины затем подсчитывается на компьютере читателя пластины. Результаты передаются через индекс, который генерируется из образцов сыворотки внутреннего Стандартный положительной и отрицательной контроля.
Introduction
Последние промежуточной системы классификации была создана для оказания помощи с диагнозом начальных этапов T1D больных. Точное определение человека островок аутоантител играет важную роль в выявлении и постановка presymptomatic тип 1 диабет, как наличие аутоантител островок указывает на присутствие β-клеток аутоиммунных заболеваний. Скорость, на которой диабет влияет на пациентов из первоначального возникновения β-клеток аутоиммунитета симптомом болезни, связанные с количество и тип островок аутоантител, является переменной2,3.
Возраст аутоантител сероконверсии, титр и близость островок аутоантител может повлиять на скорость прогрессирования симптоматическая тип 1 диабет4,5,6,7,8 ,9,10. Недавно развитые ECL анализов были тщательно проверены, продемонстрировали повышенная чувствительность и являются более конкретных заболеваний10,11,12,13. Эти анализы улучшения прогнозирования и постановка риска мочеизнурения через ранее обнаружения аутоантител островок. Они более точно отмечать начало островок аутоиммунных заболеваний и игнорировать сигналы низкого сродства и низкого риска, не имеющие отношения к диабета.
В assay ЭСЛ аутоантител в сыворотке, если он присутствует, мост сульфогруппу тег конъюгированных антиген антиген биотинилированным захвата в жидкой фазы. После моста, биотин компоновщик поймали в твердой фазе и обнаружен через ECL сульфогруппу метки на пластину стрептавидина покрытием (рис. 1).
В этом обзоре главным образом используются одного антитела ECL анализов с человека островок аутоантител. Вкратце мультиплексируются антитела, которые анализов на основе единого ECL анализов будет обсуждаться. Мультиплекс assay может использоваться для идентификации нескольких, до 10, аутоантител в пределах одного хорошо, с использованием 15 мкл сыворотки. Этот assay простой высокой пропускной способности может использоваться для экран, одновременно, несколько аутоантител для нескольких соответствующих аутоиммунных заболеваний среди населения в целом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Островок аутоантител в настоящее время являются наиболее надежным биомаркеров для аутоиммунных заболеваний диабетом типа 1. Они Марк начала островок конкретных аутоиммунных заболеваний и определить риски явной болезни. ECL assay для островок аутоантител, широко протестирован в нескольких национальных и международных тип 1 диабета клинических испытаний. Assay показал, повышенная чувствительность и специфичность по сравнению с текущей «золото» Стандартный РБАГ. ECL assay показал его превосходное преимущество для более высоких характерности болезни взыскательные высокоспецифичные и риска островок аутоантител от низкого риска, низкого сродства сигналы, генерируемые РБА. Это особенно заметил по предметам, которые являются только один островок аутоантител позитивные и никогда не продвинулись на диабет типа 1. Большинство этих низкого сродства аутоантител были найдены, чтобы быть потеряны во время следить за тестирование сделано в течение месяцев, лет, ведут себя как «временных позитивных». Как ранее предположил, эти низкого сродства, которую «одиночных» аутоантител вероятно в результате иммунизации с молекулой cross-reactive. Хотя выше сродство выше риск островок аутоантител в результате иммунизации с антигенами островок, сами. Кроме того ЭСЛ анализы продемонстрировали способность осуществил время «сероконверсии» от текущего стандартного радио привязки анализов (РБА) по годам в детей с преддиабет, которые использовались для клинических диабет от рождения. Текущих международных клинических испытаний, экологические детерминанты диабета в молодых (Тедди), зависит от точного обнаружения для точного определения сроков и появление первых островок аутоантител «сероконверсии» в ознаменование начала островок аутоиммунные заболевания и выявления экологических триггеры. Возможная причина повышенной чувствительности в ECL assay является assay захватывает всех классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, или IgE, вместо традиционных РБА или ELISA, которые полагаются только на выявление IgG.
В ECL анализов, для некоторых конкретных аутоантител как IAA привязки аутоантител к антигену, как представляется, тормозится некоторых компонентов, присутствующих в нормальной человеческой сыворотки. Чтобы удалить или освободить это торможение, кислотная обработка образцов сыворотки было необходимо сделать, прежде чем сыворотка была инкубировали с антигеном. Как показано на [рисунке 5], ЭСЛ-IAA assay привязку деятельности моноклонального антитела мыши инсулина и аутоантител сыворотке крови пациентов с антигеном был значительно усовершенствован. Подкисление образцов сыворотки, используемых в антитела анализов, обычно применяется к отделить ранее существовавших привязанных комплексов. Механизм позади как IAA сигналы тормозится в образцах сыворотки крови человека и выпущенная подкисления сыворотки не известно, но этот метод был использован в других ECL на основе анализов14,15.
В нескольких случаях, когда маркировки молекул биотин или сульфогруппу тега, обозначая positionsinside антигена белковых молекул, на, или очень близко к ключевым epitopes антитела привязки, который может вмешиваться в действие привязки к антителам. Это позволит уменьшить чувствительность пробирного и может полностью разрушить assay. Для обычной процедуры маркировки максимизации или насыщенность желательно для каждой молекулы белка антигена для создания максимальной активности или сигнала на обозначенные молекулу путем максимального маркировки потенциала все возможные позиции маркировки. Ненасыщенных маркировки должны выполняться путем уменьшения молярное соотношение маркировки молекул (биотина и сульфогруппу тегов) для антигена протеина, если маркировка на антиген становится возможной причиной прерывания деятельности антитела binding. Майор epitopes могут быть лучше защищены и прерывания деятельности связывания антител может быть освобожден с помощью ненасыщенных маркировки стратегия в большинстве случаев.
Каждая проба должна включать внутренний стандарт высокие положительные и отрицательные контроль для расчетов индекса неизвестных образцов. Низкая положительный контроль вблизи верхнего предела пробирного обычных элементов управления важно включить мониторинг анализа чувствительности. Лаборатории должны держать достаточно аликвоты стандартных положительной и отрицательной контроля для длительного использования и все аликвоты должны храниться при температуре-20 ° C. Для анализа качества анализов должны запускаться в дубликаты для каждой выборки и каждый положительный результат должен быть подтвержден повторять образец в отдельном assay. Третья проба необходим, когда вторая подтверждающие assay не согласен с первой пробы и результаты двух анализов, которые соглашаются (например., +, + или-, -), будет окончательное определение положительный или отрицательный результат.
С платформой для одного ECL анализов мультиплексированных пробирного может быть расширена по от них. Одновременно он может определить до 10 разных аутоантител в одной одной скважины с небольшое количество сыворотки. В настоящее время четыре островок аутоантител, включая IAA, Гада, IA-2A и ZnT8A равны в важности прогнозирования риска прогрессии к T1D в обоих родственников больных с T1D и населения в целом. Методов, используемых для отбора этих 4 аутоантител, используя текущие измерения одного аутоантител трудоемким и неэффективным, особенно для больших масштабах населения скрининга. Важно отметить, что до 40% пациентов с T1D имеют дополнительное условие аутоиммунных16,17,18. К сожалению это не простой и недорогой инструмент для экрана для этих условий. Мультиплекс assay ECL способен не только объединения 4 текущих основных островок аутоантител анализов в один, но также способны далее объединить больше аутоантител анализов из других соответствующих аутоиммунных заболеваний. Это позволяет эффективно проводить высокой пропускной способности, скрининг на несколько аутоиммунных заболеваний одновременно в больших масштабах населения. В мультиплекс ECL assay как показано на [рисунке 6], каждый комплекс антител антигена, образованная в жидкость фаза будет удерживаться на место источника конкретных компоновщика в то же хорошо. Приемник сигнала на компьютере читателя пластины может распознать сигналы от 10 различных источников пятен. Однако пятна с чрезвычайно высокий сигнал может генерировать высокий пробирного фон и помехи соседних пятна через кросс talk. По этой причине верхний предел сигналов для калибровочных аутоантител должна быть ограничена менее 20 000 пунктам. По нашему опыту аутоантитела с нижнего стола следует относительно далеко от этих мест, имеющих выше пунктам, когда пятно карта предназначена. Для долгосрочных исследований с использованием мультиплексных ECL анализов рекомендуется использовать же компоновщик для assay же аутоантител держать assay последовательной.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH Грант DK32083, JDRF Грант 2-SRA-2015-51-Q-R.
Materials
| Human recombinant proinsulin protein(PINS) | AmideBio | Human Proinsulin, Rec | |
| Human recombinant GAD65 protein | Diamyd | rhGAD65 | |
| Human recombinant IA-2 protein | Creative BioMart | IA2 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA-ALORICH | A7906-500G | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| Streptavidin coated plate | MSD | L15SA | |
| Zeba sizing spin column | Thermo Fisher Scientific | 89890 | |
| Twen-20 | Fisher | BP337-500 | |
| HCl | Fisher | A144-500 | |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
| EZ-Link Biotin | Thermo Fisher Scientific | PI21329 | |
| Sulfo-tag | MSD | R91AO-1 | |
| Blocker A | MSD | R93AA-1 | |
| 4x Read Buffer T with Surfactant | MSD | R92TC-1 | |
| EZ-Link NHS-PEG4-Biotin | ThermoScience | 21329 | |
| Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
| 96-well polymerase chain reaction (PCR) plate | Fisher brand | 14230232 | |
| 96-Well Streptavidin plate | MSD GOLD | L 15SA-1 | |
| Zeba Spin Desalting Column | ThermoScience | PL208984 | |
| 96-well Plate Shaker | Perkin Elmer | 1296-003 | |
| Plate Reader | MSD | QuickPlex SQ120 | |
| Benchtop centrifuge with bucket rotary | Beckman | Allegra X-15R |
References
- Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
- Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
- Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
- Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
- Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
- Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
- Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
- Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
- Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
- Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
- Yu, L. . Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
- Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
- Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
- Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
- Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
- de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).
