JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Electrochemiluminescence testen voor menselijke Islet autoantilichamen

Published: March 23, 2018
doi:
10.3791/57227
, , , , ,
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes,University of Colorado Denver, 2Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

Summary

Hier voorgesteld hebben we de methoden voor het detecteren van menselijke islet autoantilichamen met behulp van electrochemiluminescence (ECL) testen. Het protocol, gebruikt voor het voorspellen van type 1 diabetes, kan worden uitgebreid om te detecteren autoantilichamen voor andere auto-immune ziekten.

Abstract

Dicht islet autoantilichamen geassocieerd met type 1 diabetes leidt (T1D) de weg naar project en ontmoedigen deze ziekte onder de algemene bevolking. Een roman ECL-test is een nonradioactive vloeistof fase assay voor islet autoantilichamen met hogere gevoeligheid en specificiteit dan de huidige ‘goud’ standaard radio-bindende bepaling (RBA). ECL testen kunnen nauwkeuriger het intreden van presymptomatisch T1D definiëren door de zeer riskante, hoog-affiniteit autoantilichamen onderscheiden van de ongevaarlijke, lage-affiniteit autoantilichamen gegenereerd in RBAs en conventionele enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA ). Het antigeen eiwit gebruikt in deze ECL-test wordt gelabeld met Sulfo-tag en biotine, respectievelijk. De assay van elke ECL-autoantibody die gebruikmaakt van een bepaald antigeen eiwit moet een optimalisatie-stap voordat deze kan worden gebruikt voor laboratorium toepassing. Deze stap is vooral belangrijk bij het bepalen van de eisen voor serum zure behandelingen, concentraties en verhoudingen van de twee verschillende antigenen aangeduid met Sulfo-tag en biotine. Voor het uitvoeren van de bepaling, serum monsters worden vermengd met Sulfo-label-geconjugeerd en biotinyleerd eiwit van de antigeen in fosfaatgebufferde oplossing (PBS), die 5% vastleggen boviene serumalbumine (BSA). Daarna worden de monsters ‘s nachts geïncubeerd bij 4 ° C. Dezelfde dag werd is een daar beklede plaat bereid met blocker buffer en ‘s nachts bij 4 ° c geïncubeerd Op de tweede dag, het wassen van de plaat daar en breng het mengsel van de serum-antigeen op het bord. Plaats de plaat op de plaat shaker, instellen op lage snelheid en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Vervolgens, de plaat weer wordt gewassen en lezer buffer wordt toegevoegd. De plaat wordt vervolgens op de computer van de lezer plaat geteld. De resultaten worden overgebracht door middel van een index, die is gegenereerd op basis van interne standaard positieve en negatieve controle serummonsters.

Introduction

Een recente tijdelijke classificatiesysteem is opgezet om te helpen bij de diagnose van de beginfase van T1D bij patiënten. Exacte detectie van menselijke islet autoantilichamen speelt een belangrijke rol bij het identificeren en enscenering presymptomatisch type 1diabetes, als de aanwezigheid van islet autoantilichamen duidt op de aanwezigheid van β-cel autoimmuniteit. Het tarief op welke diabetes beïnvloedt patiënten uit het eerste exemplaar van β-cel autoimmuniteit de symptomatische ziekte, die is gekoppeld aan het aantal en de soort islet autoantilichamen, is variabele2,3.

De leeftijd van autoantibody seroconversie, titer en affiniteit van islet autoantilichamen kan invloed hebben op het tempo van de progressie naar symptomatische type 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Onlangs ontwikkelde ECL testen uitgebreid zijn gevalideerd, verhoogde gevoeligheid hebben aangetoond, en zijn meer ziektespecifieke10,11,–12,13. Deze testen vergroten de voorspelling en de enscenering van diabetesrisico door eerdere detectie van islet autoantilichamen. Ze nauwkeuriger markeert de opening van islet autoimmuniteit en negeren de lage-affiniteit en lage risico signalen niet relevant zijn voor diabetes.

In een ECL assay, de autoantilichamen in het serum, indien aanwezig, een brug het antigeen Sulfo-label-geconjugeerd aan het biotinyleerd vangen antigeen in de vloeibare fase. Na het overbruggen, is de linker Biotine gevangen in de vaste fase en gedetecteerd door ECL door de Sulfo-tag op de plaat daar bekleed (Figuur 1).

In deze review worden één antilichaam ECL testen met menselijke islet autoantilichamen voornamelijk gebruikt. Kort, multiplexed antilichaam testen op basis van één ECL testen zullen worden besproken. De multiplex assay kan worden gebruikt voor identificatie van meerdere, tot 10, autoantilichamen binnen één goed, met behulp van 15 µL van de serum. Deze eenvoudige hoge doorvoer assay kan worden gebruikt om het scherm, gelijktijdig, meerdere autoantilichamen voor meerdere relevante auto-immune ziekten onder de algemene bevolking.

Protocol

1. buffer voorbereiding Labelen van buffer (2 x PBS, pH 7,9): In 400 mL zuiver gedestilleerd gedeïoniseerd (DD) water, voeg 100 mL 10 x PBS, breng pH op 7,9 met NaOH. 3 mM van biotine: Los 1 mg Biotine in 588 µL van labeling buffer. 3 mM van Sulfo-tag: ontbinden 150 nmol van Sulfo-tag in 50 µL van labeling buffer. Antigeen buffer (5% BSA): In PBS 1 x 500 mL, voeg toe 25 g van boviene serumalbumine (BSA). 0.5 M azijnzuur-oplossing te bereiden. 1,0 M Tris-HCl buffer pH 9.0: bereiden 1 M Tris-HCl buffer en breng pH op 9.0 met HCl. Coating buffer (3% Blocker A): In PBS 1 x 500 mL, voeg toe 15 g Blocker A. Wassen buffer (0,05% Tween-20, PBST): In 5000 mL 1 x PBS, voeg 2,5 mL tween-20. Lezing buffer (2 x Lees Buffer T met oppervlakteactieve stof): In 500 mL DD water, voeg 500 mL 4 x Lees Buffer T met oppervlakteactieve stof (Tabel van materialen). Biotine en Sulfo-tag opslaan in een vriezer van-20 ° C.Opmerking: Beide Biotine en Sulfo-tag oplossingen moeten altijd net vóór de labeling procedure vers worden bereid. 2. de Autoantigen van de menselijke Islet met biotine en Sulfo-tag label Opmerking: Een hoge concentratie van antigeen, ≥0.5 mg/mL, wordt aanbevolen voor een efficiëntere labeling reactie. Bepalen de molaire verhouding van menselijke islet autoantigen voor Biotine en Sulfo-tag. Het antigeen molaire nummer verkrijgen door het verdelen van het gewicht van het antigeen door het molecuulgewicht. Gebruik de molaire ratio van 1:5 voor het antigeen met kleinere molecuulgewicht (≤10 kd), en de molaire ratio van 1:20 voor de antigeen met grotere molecuulgewicht (> 50 kd). Het berekenen van het volume voor biotine of Sulfo-tag door de molaire aantal te delen door de concentratie ervan. Meng de menselijke eilandje autoantigen met biotine of Sulfo-tag met de molaire ratio van 1:5.Let op: De eiwitten in tris of glycine buffer systemen moet worden uitgewisseld voor 2 x PBS buffer met pH 7,9 met behulp van de formaatgrepen spin kolom. Aangezien Biotine en Sulfo-tag lichtgevoelig zijn, hebben betrekking op de reactie buizen met aluminiumfolie. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur. Tijdens de incubatie, prime de spin kolom door verstrekking 2 x PBS buffer in de kolom drie keer. Centrifugeer de oplossing bij 1000 x g gedurende 2 min telkens.Opmerking: Momenteel de labeling reactie, via overbruggen, zich nog steeds voordoet en moet worden gestopt. Stop de labeling reactie door het zuiveren van de gelabelde menselijke islet-autoantigen. Als u wilt zuiveren, doorgeven van de autoantigen door de spin kolom en centrifugeer de kolom bij 1000 x g gedurende 2 min. Bepaal de concentratie (µg/µL) van de gelabelde antigeen met behulp van de hoeveelheid antigeen eiwit en het eindvolume.Opmerking: Ongeveer, er zullen 90-95% retentie van gelabelde antigeen nadat elke spin kolom voorbij. Aliquot de gelabelde antigeen en winkel gelabelde antigeen bij-80 ° C. 3. Geef de beste concentraties en ratio’s voor de twee gelabelde antigenen voor de Assay (Checker Board Assay) Twee serummonsters, een hoge positieve en één negatieve, met een totaal volume van 200 µL voor elk voor te bereiden. Aliquot 4 µL van de serum en voeg 1 x PBS totdat het eindvolume 20 µL per putje van een 96-wells-plaat voor PCR is. Gebruik de helft van een plaat voor de hoge positief monster en de andere helft voor de negatief monster, zoals weergegeven in figuur 2A. Voeg 10 µL van biotine en 10 µL van Sulfo-tag antigeen en gedrag seriële verdunningen voor de twee anders gelabelde antigenen, aangeduid als aangegeven in figuur 2A. Een horizontale seriële verdunning voor een gelabelde antigeen en een verticale seriële verdunning voor de andere gelabelde antigeen uitvoeren. Blijven de rest van de assay stappen beschreven onder 5.3 aan 9.1. Berekenen van de verhouding van de signalen van de hoge positief monster tegen elk van de overeenkomstige signalen van de negatief monster weergegeven in figuur 2B. Identificeren van de beste concentraties voor Biotine en Sulfo-tag label antigenen door het selecteren van een punt met de hoogste of in de buurt van hoogste verhouding van positief naar negatief. Overweeg het signaal van de laag achtergrond van de negatief monster te identificeren van de verhouding.Opmerking: Assay dag 1 bevat stap 4 tot en met stap 6. 4. bereid de antigeen-Buffer met behulp van de juiste concentratie van biotine/Sulfo-tag met het label antigeen Selecteer de rationele concentratie van elk antigeen op basis van de bepaling van de Raad van bestuur checker. Bereiden 3 mL antigeen oplossing per plaat, met behulp van de rationele concentratie van biotine/Sulfo-tag met het label antigeen voor de antigeen-buffer. 5. Incubeer serummonsters met gelabelde antigeen Opmerking: Er zijn twee protocollen in deze sectie, een zonder serum zure behandeling en een met serum zure behandeling. Alle islet autoantibody assays behalve IAA assay gebruiken regelmatig protocol zonder de zure behandeling van de serum van stappen 5.1 tot 5,5, terwijl IAA assay deze stappen overgeslagen en maakt gebruik van protocol met de zure behandeling van de serum van stappen 5.6 tot 5,9. Aliquot 4 µL van de serum en voeg 1 x PBS totdat het eindvolume 20 µL per putje van een 96-wells-plaat voor PCR is. Voeg 20 µL van gelabelde antigeen oplossing per putje. De PCR afdekplaat met folie om te voorkomen dat licht afdichting. Zet de plaat op een shaker (lage snelheid) op RT gedurende 2 uur. Zet de plaat in de koelkast 4 ° C en incubeer overnachting (18-24 h).Opmerking: Het volgende protocol van stappen 5.6 tot 5,9 is alleen ontworpen voor IAA assay en andere tests autoantibody u deze stappen overslaan. Mix 15 µL van de serum met 18 µL van 0.5 M azijnzuur voor elke serummonster. Incubeer dit mengsel op RT voor 45 min. Bereid de antigeen-oplossing met de rationele concentratie van biotine en Sulfo-tag met het label antigeen, gebaseerd op de checker boord assay, met behulp van antigeen buffer. In elk goed, aliquoot 35 µL van antigeen buffer, met biotine en Sulfo-tag met het label antigeen, in een nieuwe PCR-plaat. Voordat de 45 min incubatie (stap 5.6) stap is voltooid, voeg 8.3 µL van 1 M Tris pH 9.0 buffer naar de kant van elk putje op de antigeen-plaat (stap 5.6). Het is belangrijk om te beperken het mengen tussen de Tris-buffer en het antigeen. Onmiddellijk overdracht van 25 µL van de serum, die wordt behandeld met zuur, in stap 5.6, in elk putje en doorroeren van de oplossing. De PCR afdekplaat met folie om te voorkomen dat licht afdichting. Zet de plaat op een shaker (lage snelheid) op RT voor 2 h. de plaat in de koelkast 4 ° C zet en laat de plaat aan het broeden overnachting (18-24 h). 6. voorbereiding van de plaat daar Nemen van een plaat van daar uit de koelkast 4 ° C en laat de plaat om te komen tot RT. Zodra de plaat daar op RT is, toevoegt 150 µL van 3% Blocker A aan elk putje. De PCR afdekplaat met folie afdichting. Incubeer de plaat in de koelkast 4 ° C’s nachts.Opmerking: Assay dag 2 omvat stap 7 tot en met stap 9. 7. overdracht Serum/antigeen leggen aan de streptavidine plaat De volgende dag, neem de streptavidine plaat uit de koelkast en negeren de buffer van de plaat. Sommige droge papieren handdoeken uiteengezet op de tabel en tik ondersteboven op de plaat zolang er geen geen meer buffer binnenkant van de putten. Vul de lege streptavidine plaat met PBST 150 µL per putje en gooi de PBST van de plaat voor een totaal van drie wast. Overdracht van 30 µL van de serum/antigeen leggen per putje in de plaat daar. De afdekplaat met folie om te voorkomen dat licht. Schud de plaat, bij een lage instelling, op RT gedurende 1 uur. 8. Spoel de plaat en lees Buffer toevoegen Discard leggen van de plaat. Voeg 150 µL van PBST per putje en gooi de PBST van de plaat voor een totaal van drie wast. Na het wassen, toevoegt 150 µL per putje van lezing buffer.Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen dat de luchtbellen in de oplossing, omdat dit zal invloed hebben op hoe de plaat is lezen op de plaat lezer machine. 9. Lees de plaat en analyseren van gegevens Tellen de plaat op de plaat lezer machine. Antilichaam-waarden worden weergegeven als punten per seconde (CPS). Brengen de antilichaam-niveaus van de plaat lezer machine als een relatieve index ontvangen. Berekening van de index van de volgende vergelijking:Indexwaarde = [CPS (voorbeeld) – CPS (negatieve controle)] / [CPS (positieve controle) – CPS (negatieve controle)]. Identificeren van antilichaam van positieve en negatieve resultaten met behulp van de licht-donkerscheiding voor positiviteit, gedefinieerd op basis van de 99e percentiel van 100 gezonde controle onderwerpen (niet-diabetische individuen zonder enige bekende auto-immune ziekten en die heb geen familie geschiedenis van diabetes).

Representative Results

Figuur 2 toont de checker boord. Het is aangetoond dat 250 ng/mL van biotine en 250 ng/mL Sulfo-tag gelabelde antigeen zijn de meest rationele gebruikte in de bepaling dat de signalen van de hoge positieve controlemonster, de negatieve controlemonster gezien als de bepaling de achtergrond, en de verhouding tussen de concentraties positieve naar negatieve signalen. Met de geoptimaliseerde concentraties van deze twee gelabelde antigenen, werd de test uitgevoerd met de serummonsters van 100 nieuw gediagnosticeerde patiënten met T1D en 100 gezonde controles. De indexwaarde van 0.023 werd gedefinieerd als de cut-off assay voor positiviteit. Dit vertegenwoordigt 85% gevoeligheid in patiënten en 99% specificiteit in gezonde controles met behulp van de ontvanger die karakteristiek (ROC) curve weergegeven in figuur 3A. De assay voor de onbekende monsters werd uitgevoerd met interne standaard hoge positieven, lage positieven en negatieve controlemonsters. De resultaten van de graven van de CPS worden weergegeven tabel 2A. Het gemiddelde CPS van hoge en lage positieve controles worden gemarkeerd in het rood, 17903 [(19940+15866)/2] en 839 [(857+820)/2], en de negatieve controles worden gemarkeerd in het groen, 168 [(170+165)/2]. De index voor de onbekende monsters wordt berekend door “(CPSmonster-168)/(17903-168).” Tabel 2B de berekende indexwaarden weergegeven voor alle monsters. De indexwaarden die groter zijn dan 0.023 zijn geschreven in het rood, overeenkomt met de waarden van de CPS ook geschreven in rood weergegeven in tabel 2A. Deze waarden zullen worden vastgesteld als de positieve resultaten die groter dande 99 percentiel van de controle van de gezonde bevolking zijn . Wanneer de concentratie van een irrationele antigeen wordt gebruikt, de bepaling zal een hoge achtergrond hebben, zoals aangegeven in tabel 2 C. Lage niveaus van positieve antistoffen zal worden gemist als de waarden A2, A5, D1 en H4 grijs in tabel 2Dgemarkeerd. Figuur 1 : Afbeelding van een tweewaardig plaat vangen op een enkele ECL-IAA assay. Het eilandje autoantibody in het serum bruggen de Sulfo-tag geconjugeerd antigeen aan de biotinyleerd vangen antigeen, die is vastgelegd in de vaste fase op de daar beklede plaat. Detectie van plaat-gevangen Sulfo-tag geconjugeerd antigeen wordt bereikt door middel van ECL. Dit cijfer is gewijzigd van Yu, et al.. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : De ROC curve voor het bepalen van de licht-donkerscheiding van assay positiviteit. De 99 percentiel van specificiteit overeenkomt met 85% gevoeligheid werd geselecteerd en wordt weergegeven als een indexwaarde van 0.023. Deze bovengrens van de bepaling is ontleend aan 100 gezonde controles. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Afbeelding van normaal humaan serum ECL-IAA signalen blokkeren. A: de signalen van ECL-IAA testen met een insuline monoklonaal antilichaam (MoAb) drastisch werden geblokkeerd door de toevoeging van normale menselijk serum. Bij het vergelijken van MoAb in PBS, werd het signaal gedeeltelijk hersteld wanneer het menselijk serum met zuur behandeld werd. B: signalen van een ECL-IAA-assay met 4 patiënt sera waren aanzienlijk verbeterd met zure behandeling. Dit cijfer is gewijzigd van Yu, et al.. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Illustratie van de bepaling van de Mutiplex ECL. Antilichaam-antigeen complexen worden gevormd in de vloeistof-fase met specifieke linkers. De specifieke antilichaam-antigeen-linker complexen zijn gefixeerd op elk van de specifieke linker-spots in hetzelfde goed. De plaat lezer machine is in staat om te onderscheiden van de signalen van verschillende bronnen van spots en geeft CPS graven op 10 verschillende kanalen, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Tabel 1: Checker boord assay bepaalt de concentraties en de ratio’s van biotine en Sulfo-tag met het label antigenen. A: raw CPS rekent voor de checker boord plaat met hoge positief serum op de helft van de plaat en negatief serum op de andere helft. De concentratie van biotinyleerd antigeen was horizontaal verdund in serie en de concentratie van Sulfo-tag met het antigeen label was verticaal verdund in serie. B: de waarden van de verhouding van de graven van de CPS uit de hoge positief serum tegen elk van hun overeenkomstige graven van de CPS uit de negatief serum. De geel gemarkeerde putten vertegenwoordigen de beste verhouding van positief naar negatief in deelvenster B. Deze verhouding komt overeen met de 250 ng/mL Biotine en 250 ng/mL Sulfo-tag label antigeen concentraties in deelvenster A met een aanvaardbaar lage telling van het CPS voor negatief serum. Klik hier voor een grotere versie van deze tabel. Tabel 2: analyse van de resultaten van de assay. A: raw CPS telt van de assay plaat met de hoge en lage positieve standaardbesturingselementen gemarkeerd in rood en de negatieve standaardbesturingselementen gemarkeerd in het groen. Elk monster werd gedupliceerd in de test. B: Index waarden werden berekend, zoals wordt beschreven in het test protocol. Elke indexwaarde dat groter dan 0.023 was werd gedefinieerd als een positief resultaat, gemarkeerd in het rood. C: raw CPS wordt geteld van de assay plaat met dezelfde set van monsters, wanneer een irrationele antigeen concentratie werd gebruikt. Dit resulteerde in een hoge achtergrond en sommige lage stellig normaal gesproken gedetecteerd, zoals wordt weergegeven in het deelvenster B, werden omgebouwd tot negatieven, grijs in deelvenster D. gemarkeerd Klik hier voor een grotere versie van deze tabel.

Discussion

Islet autoantilichamen zijn momenteel de meest betrouwbare biomarkers voor autoimmuniteit van type 1 diabetes. Ze markeren het begin van de specifieke autoimmuniteit islet en openlijke ziekte risico’s te bepalen. Het ECL assay, voor islet autoantilichamen, is uitgebreid gevalideerd in meerdere nationale en internationale type 1 diabetes klinische proeven. De bepaling heeft aangetoond verhoogde gevoeligheid en specificiteit ten opzichte van de huidige ‘goud’ standaard RBAs. De bepaling van het ECL blijkt haar superieure voordeel voor hogere specificiteit van de ziekte door discriminerende hoge-affiniteit en risicovolle islet Autoantilichamen tegen laag risico, lage-affiniteit signalen gegenereerd door de RBA. Dit is vooral opgemerkt bij proefpersonen die slechts één islet autoantibody positief en nooit om het type 1diabetes hebben gevorderd. De meeste van deze lage affiniteit autoantilichamen bleken te zijn verloren tijdens de follow-up testen gedaan binnen maanden tot jaren, gedraagt zich als een ‘van voorbijgaande aard positief.” Zoals eerder hypothetische, deze lage affiniteit ‘single’ autoantilichamen waarschijnlijk het gevolg van immunisatie met een cross-reactive molecuul. Terwijl de hogere affiniteit gevolg hoger risico islet autoantilichamen van immunisatie met de eilandje-antigenen zelf. ECL-tests hebben daarnaast de mogelijkheid om de tijd van ‘seroconversie’ van de huidige standaard radio-bindende analyses (RBA) antedate door jaar in kinderen met pre-diabetes, die werden gevolgd tot klinische diabetes vanaf de geboorte aangetoond. Een voortdurende internationale klinische proef, het milieu determinanten van Diabetes in de jonge (TEDDY), hangt af van nauwkeurige detectie voor het lokaliseren van de timing en de vormgeving van de eerste islet autoantibody ‘seroconversie’ ter gelegenheid van het allereerste begin van islet autoimmunity en voor het identificeren van milieu triggers. Een mogelijke reden voor verhoogde gevoeligheid in de ECL-bepaling is dat de bepaling alle immunoglobulin klassen vangt: IgG, IgM, IgA, of IgE, in plaats van de traditionele RBA of ELISA die alleen afhankelijk zijn van de opsporing van IgG.

ECL testen, voor sommige bijzondere autoantilichamen zoals de IAA, lijkt de binding van autoantilichamen aan het antigeen te worden geremd door sommige component aanwezig in normale menselijk serum. Om te verwijderen of het vrijgeven van deze remming, moest zure behandeling van serummonsters doen voordat het serum was geïncubeerd met antigeen. Als blijkt uit [Figuur 5], ECL-IAA assay, de bindende activiteiten van zowel de muis insuline monoklonaal antilichaam en patiënten serum autoantilichamen met het antigeen werd sterk verbeterd. De verzuring van serummonsters, gebruikt in antilichaam testen, wordt meestal toegepast verbreken van bestaande afhankelijke complexen. Het mechanisme is erachter hoe IAA signalen zijn in menselijk serummonsters geremd en uitgebracht door verzuring van serum is niet bekend, maar deze methode is gebruikt in andere ECL gebaseerd testen14,15.

In enkele gevallen, wanneer etikettering van moleculen, zijn biotine of Sulfo-tag, de labeling positionsinside van het antigeen eiwitmolecules bij, of zeer dicht bij de belangrijkste epitopes van antilichaam binding, die met de bindende activiteit aan antilichamen interfereren kan. Dit zal verminderen assay gevoeligheid en volledig aan de bepaling kan afbreken. Voor routine labeling procedure, is maximalisatie of verzadiging gewenst voor elk antigeen eiwit molecule tot maximale activiteit of signaal per gelabelde molecuul genereren door het maximaliseren van labeling capaciteit van elke mogelijke labeling positie. Onverzadigde etikettering moet worden uitgevoerd door het verminderen van de molaire verhouding van labeling moleculen (Biotine en Sulfo-tag) aan het antigeen proteïne als etiketten op het antigeen een mogelijke reden voor onderbreking van antilichamen bindende activiteit wordt. Major epitopes kan beter gereserveerd en onderbreking van antilichamen bindende activiteit kan worden gelost met behulp van de onverzadigde labeling strategie in de meeste gevallen.

Elke bepaling dient een interne standaard hoge positieve en negatieve controle voor de berekening van de index van de onbekende monsters. Een lage positieve controle in de buurt van de bepaling van de bovengrens van normale besturingselementen is het belangrijk om op te nemen voor de monitoring van de gevoeligheid van de test. Het laboratorium moet houden voldoende aliquots van positieve en negatieve standaardbesturingselementen voor langdurig gebruik en alle aliquots moeten worden opgeslagen bij-20 ° C. Voor de waarborging van de kwaliteit van de bepaling, testen in duplicaten voor elk monster moeten worden uitgevoerd en elk positief resultaat moet worden bevestigd door het herhalen van het monster in een afzonderlijke kwantitatieve analyse. Een derde test is nodig wanneer de tweede confirmatieve bepaling niet eens is met de eerste test en de resultaten van twee tests, die eens (bv., +, + of-, -), zullen de definitieve vaststelling van een positief of negatief resultaat.

Met het platform ingesteld voor één ECL testen, kan een multiplexed assay worden uitgebreid van deze. Het kan maximaal 10 verschillende autoantilichamen in één enkele goed met een kleine hoeveelheid serum gelijktijdig bepalen. Op dit moment zijn vier islet autoantilichamen met inbegrip van IAA, GADA, IA-2A en ZnT8A gelijk belang voor de voorspelling van het risico van progressie naar T1D in beide familieleden van patiënten met T1D en de algemene bevolking. De methoden die zijn gebruikt voor de screening van deze 4 autoantilichamen met behulp van de huidige interne autoantibody metingen zijn moeizaam en inefficiënt is, met name voor grote schaal bevolking screening. Nog belangrijker is, tot 40% van de patiënten met T1D hebben een extra auto-immune aandoening16,17,18. Helaas, er is geen gemakkelijke en goedkope hulpmiddel aan het scherm voor deze voorwaarden. De multiplex ECL-test is niet alleen geschikt voor combineren van 4 huidige grote islet autoantibody testen in een, maar ook vermag verder combineren meer autoantibody testen van andere relevante auto-immune ziekten. Dit maakt het mogelijk om efficiënt hoge throughput screening voor meerdere auto-immuunziekten tegelijk in grootschalige populaties. In de multiplex ECL assay, zoals in [Figuur 6], zal elk complex van de antilichaam-antigeen gevormd in de vloeistof-fase worden gefixeerd aan een specifieke linker bron vlek in hetzelfde goed. De signaalontvanger op de plaat lezer machine is in staat om te herkennen van de signalen van 10 verschillende bronnen van vlekken. Echter kunnen de vlekken met een extreem hoge signaal genereren een hoge assay achtergrond en storing naar naburige plaatsen door middel van cross-talk. Om deze reden, moeten de signalen van de bovengrens voor de assay van elke autoantibody worden beperkt tot minder dan 20.000 graven. Onze ervaring, moeten de autoantilichamen met lagere achtergronden worden geplaatst relatief ver weg van deze plekken hebben hogere graven wanneer de spot kaart is ontworpen. Voor lange termijn studies met multiplex ECL testen, is het aanbevolen dat de dezelfde linker worden gebruikt voor de dezelfde autoantibody assay de bepaling om consistent te houden.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de NIH DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R verlenen.

Materials

Human recombinant proinsulin protein(PINS) AmideBio Human Proinsulin, Rec
Human recombinant GAD65 protein Diamyd rhGAD65
Human recombinant IA-2 protein Creative BioMart IA2
1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
10x PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 70011-044
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA-ALORICH A7906-500G
96-well PCR plate  Fisher 14230232
Streptavidin coated plate MSD L15SA
Zeba sizing spin column Thermo Fisher Scientific 89890
Twen-20 Fisher BP337-500
HCl Fisher A144-500
NaOH Fisher SS255-1
Trizma Base Fisher BP152-5
EZ-Link Biotin Thermo Fisher Scientific PI21329
Sulfo-tag MSD R91AO-1
Blocker A MSD R93AA-1
4x Read Buffer T with Surfactant MSD R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-Biotin ThermoScience 21329
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
96-well polymerase chain reaction (PCR) plate Fisher brand 14230232
96-Well Streptavidin plate MSD GOLD L 15SA-1
Zeba Spin Desalting Column ThermoScience PL208984
96-well Plate Shaker Perkin Elmer 1296-003
Plate Reader MSD QuickPlex SQ120
Benchtop centrifuge with bucket rotary Beckman Allegra X-15R
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Insel, A. I., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  2. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. . Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).
  3. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. . Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  4. Steck, A. K., et al. TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).
  5. Krischer, J. P., et al. TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study. Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).
  6. Achenbach, P., et al. Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics. Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).
  7. Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. . Natural history of type 1 diabetes. Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).
  8. Steck, A. K., et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).
  9. Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).
  10. Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. . Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  11. Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. . Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  12. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  13. Yu, L. . Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay. Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).
  14. Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. . Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients. J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).
  15. Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).
  16. Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups. Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).
  17. Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset. Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).
  18. de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. . Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus. Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).

Tags

ElectrochemiluminescenceIslet AutoantibodiesType 1 DiabetesAutoimmuneNon-radioactiveRadioassayELISAInsulin AutoantibodyBiotinSULFO-TAGSpin ColumnCheckerboard AssayPhosphate Buffered Saline

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gu, Y., Zhao, Z., Miao, D., High, H., Yang, T., Yu, L. Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies. J. Vis. Exp. (133), e57227, doi:10.3791/57227 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image