Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması
Summary
Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.
Abstract
Ayirt doku bölümlerinde farklı hücre tipleri tanımlamak için yardımcı olan etkili bir yöntemdir. İstenen hücre nüfus çalışma için antikorlar belirli hücre işaretçileri için doku bölümlerde uygulanır. Yetişkin iskelet kas, uydu (SCs) kas onarım ve rejenerasyon katkıda kök hücre hücrelerdir. Bu nedenle, görselleştirmek ve uydu hücre nüfus farklı fizyolojik koşullar altında izlemek önemlidir. İskelet kas istirahat, SCs Bazal lamina ve myofiber plazma zarı arasında yer alır. Myofibers veya hücre kültürü SCs tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici Pax7 Eşli kutu proteindir. Bu makalede, en iyi duruma getirilmiş bir Pax7 ayirt protokol kas iskelet bölümleri üzerinde non-spesifik boyama ve arka plan en aza indiren sunulur. Bir protein (laminin) Bazal lamina tanır başka bir antikor SCs. benzer protokoller tanımlamanıza yardımcı olması için de Pax7 ve ilgi ek proteinler için antikorlar ile ikili veya üçlü etiketleme gerçekleştirmek için kullanılabilir da eklendi.
Introduction
Kas iskelet multinucleated kas hücreleri oluşur, myotubes denilen, kuvvet ve daralma ile hareketleri oluşturmak myofibers düzenlenmektedir. En iskelet kasları kraniyofasiyal bazı kasları dışında bir somite1adında bir geçici embriyonik yapısından türetilir. Myogenic öncül hücreleri epitel somite myoblasts olmak için delaminate. Myoblasts daha da çok çekirdekli myofibers oluşturmak için myotubes olmak için sigorta miyositler ayırt etmek. Yukarıdaki işlem myogenesis denir ve gen ekspresyonu tarafından geçici düzenlenir kontrolünü ile karakterizedir. Myogenic Kara filmin tarih öncesi Pax3 ve Pax7, oysa myoblasts Tanrım hızlı ve/veya2,3myogenin ve myosins Myf5 ve miyositler hızlı hızlı. Kas büyüme hangi myofibers daha fazla myonuclei varolan lifleri (Hiperplazi) birleşmeyle ve kas lif boyutu (hipertrofisi)4bir artış daha büyük olmak bir süreçtir. Kas büyüme sırasında onlar ayırt etmek ve kendi kendini yenilemek kök hücre özelliklerine sahip myogenic hücre sürdürülebilir bir kaynağıdır. Bu hücreler uydu fiziksel konumlarını sarcolemma (myofiber, hücre zarı) ve Bazal lamina5arasındaki temel hücre denir. SCs şiddetle Juvenil aşamasında (doğum sonrası fareler ilk 2-3 hafta) kas büyümesine katkıda bulunmak, ama yetişkin kas6dinlenme sakin ol. Dikkat çekici, onlar-ebilmek var olmak yanıt kas olarak yeniden Aktif kişi yaralandı ve hasarlı kas7onarmak için yeni kas hücreleri ayırt etmek.
Kök hücre özellikleri SCs çalışmanın ilgili temel kas Biyoloji ve terapileri kas hastalıkları8için yapmak. Sonuç olarak, son yıllarda yoğun araştırma çalışmaları bir alan olmuştur. Bir muazzam genetik ve epigenetik SCs9,10dissekan ilerlemeler kaydedilmiştir. SCs in situ tespit ve yalıtma de tekniklerin geliştirilmiş olup yol11en iyi duruma getirilmiş. İmmünfloresan boyama SCs tanımlaması için Pax7 da dahil olmak üzere belirli antikor kullanımı sağlar. Ancak, kıtlık ve bir güçlü auto-floresan ile yetişkin iskelet kas dokusunun kombine SCs küçük boyutlu görselleştirme zorlu render. Burada, biz fare kas dokusu için Pax7 için optimize edilmiş ve Zebra balığı kas12için varolan bir yöntemine dayalı bir immünfloresan boyama iletişim kuralı tanımlamak. Buna ek olarak, farklı bir fluorophore ile etiketli bir Laminin antikor Bazal lamina altında SCs yer almaktadır belirlemek için istihdam edilmektedir. Bu iletişim kuralı sürekli Pax7 pozitif SCs ve tüm test fizyolojik şartlarda ve gelişim aşamalarında altında myogenic öncüleri görselleştirme sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki Protokolü Pax7/MF20 Zebra balığı iskelet kas12tarihinde boyama yöntemi dayanıyordu. Kullanılan ve adımları engelleme çözümleri aynı veya benzer. Kullanılan antikor aynıdır. Ayarlanan adımları fare kas dokusu ve SCs özelliklerini temel. İlk olarak, Laminin antikor görselleştirmek ve SCs konumunu doğrulamak için mix eklendi. SCs mikroskop altında 488/555 çift filtre küp kullanırken saymak için özellikle yararlı; Bu büyük ölçüde gürültülü autofluore…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIAMS ışık Imaging mikroskoplar ve teknik yardım sağlamak için bölüm teşekkür ediyoruz. MF20 ve Pax7 antikor bankadan gelişim çalışmaları Hibridoma NICHD himayesinde geliştirilip Biyolojik Bilimler Bölümü Iowa Üniversitesi Iowa City tarafından elde edilmiştir. Bu eser Intramural araştırma programı, NIAMS tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri ile desteklenmiştir.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
- Buckingham, M. Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).
- Buckingham, M., Relaix, F. PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).
- Relaix, F., Buckingham, M. From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network. Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).
- Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy – Lost in Polarity. Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).
- Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Satellite cells, the engines of muscle repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).
- Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks. Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).
- Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).
- Giordani, L., Puri, P. L. Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes. FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation. Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).
- Juan, A. H., et al. Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells. Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).
- Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts. Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
