Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7
Summary
L’identification précise des cellules satellites est essentielle pour l’étude de leurs fonctions dans des conditions physiologiques et pathologiques différents. Cet article présente un protocole pour identifier les cellules satellites sur des coupes de muscle squelettique adulte par axée sur l’immunofluorescence souillant.
Abstract
Immunofluorescence est une méthode efficace qui aide à identifier les différents types de cellules sur des sections de tissu. Afin d’étudier la population de la cellule souhaitée, anticorps pour les marqueurs de cellules spécifiques sont appliqués sur des sections de tissu. Dans le muscle squelettique adulte, les cellules satellites (SCs) sont des cellules souches qui contribuent à la régénération et la réparation musculaire. Par conséquent, il est important de visualiser et de tracer la population de cellules satellites dans différentes conditions physiologiques. Dans le muscle squelettique au repos, SCs se trouvent entre la lame basale et la membrane plasmique de fibre musculaire. Un marqueur couramment utilisé pour identifier les SCs sur les myofibres ou en culture cellulaire est la protéine jumelé boîte Pax7. Dans cet article, un protocole d’immunofluorescence Pax7 optimisé sur des coupes de muscle squelettique est présenté qui minimise la coloration non spécifiques et fond. Un autre anticorps qui reconnaît une protéine (laminine) de la lame basale a également été ajouté pour aider à identifier les protocoles SCs. Similar permet également d’effectuer le double ou triple marquage avec des anticorps pour des protéines d’intérêt et de Pax7.
Introduction
Le muscle squelettique est composé de cellules musculaires multinucléées, appelé myotubes, organisé dans les fibres musculaires, qui génèrent des forces et mouvements par contraction. Plus les muscles squelettiques, à l’exception de certains muscles cranio-faciales, proviennent d’une structure embryonnaire temporaire appelée un somite1. Cellules précurseurs myogénique se délamineront depuis le somite épithélial pour devenir des myoblastes. Outre les myoblastes se différencient en myocytes qui se fusionnent pour devenir des myotubes pour former les myofibres multi nucléées. Le processus décrit ci-dessus est appelé myogenèse et se caractérise par réglementés dans le temps de contrôle de l’expression génique. Les précurseurs myogènes expriment Pax3 et Pax7, tandis que les myoblastes expriment MyoD et/ou myocytes et Myf5 express myogénine et myosines2,3. La croissance musculaire est un processus dans lequel les myofibres deviennent plus grandes incorpore plusieurs noyaux de fibres existantes (hyperplasie) et par une augmentation des fibres musculaires taille (hypertrophie)4. Au cours de la croissance musculaire, il y a une source durable de cellules myogènes ayant des propriétés de cellules souches qu’ils peuvent faire la différence et se renouveler. Ces cellules sont appelées cellules satellites basés sur leur emplacement physique entre le sarcolemme (membrane cellulaire de la fibre musculaire) et la lame basale5. SCs vigoureusement contribuent à la croissance musculaire dans le stade juvénile (les premières 2-3 semaines de souris après la naissance), mais devient quiescents au repos le muscle adulte6. Fait remarquable, elles peuvent être ré-activés en réponse à muscle blesse et se différencient en cellules de muscle nouveau de réparer le muscle lésé7.
Les propriétés de cellules souches font l’étude de SCs pertinentes pour la biologie de base musculaire et thérapies des maladies de muscle8. En conséquence, il a été un domaine de recherche intense dans les dernières décennies. Un énorme progrès ont été réalisés en disséquant la génétique et épigénétique de SCs9,10. Techniques intervenant dans l’isolement et l’identification SCs in situ ont été développés et optimisés le long de la voie11. Immunofluorescence permet l’identification de SCs grâce à l’utilisation des anticorps spécifiques, y compris celle pour Pax7. Toutefois, la rareté et la petite taille des SCs, combinée à une forte fluorescence-auto du tissu musculaire squelettique adulte rendent la visualisation difficile. Nous décrivons ici un protocole de coloration par immunofluorescence optimisé pour les tissus musculaires de souris pour Pax7 et basé sur une méthode existante pour le poisson-zèbre muscle12. En outre, un anticorps de laminine marqué avec un fluorophore distinct est utilisé pour identifier la couche basale, dans lesquelles se trouvent les SCs. Ce protocole permet toujours la visualisation de SCs Pax7 séropositifs et myogènes précurseurs dans des conditions physiologiques tous testées et stades de développement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole ci-dessus était fondé sur une méthode de coloration de Pax7/MF20 le poisson-zèbre muscle squelettique12. Les solutions utilisées et en bloquant les étapes sont identiques ou similaires. Les anticorps utilisés sont identiques. Les mesures rajustés reposaient sur les caractéristiques des tissus musculaires de souris et de SCs. Tout d’abord, laminine anticorps a été ajouté dans le mélange afin de visualiser et de confirmer la position de la SCs. Il a été particulièremen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Section NIAMS lumière Imaging pour fournir les microscopes et les aides techniques. Les anticorps MF20 et Pax7 ont obtenu de la Banque de hybridome études développement développé sous les auspices de la NICHD et maintenu par le Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de NIAMS de la National Institutes of Health.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
References
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