Summary

طريقة لقياس وظيفة الغدة اللعابية في الفئران

Published: January 25, 2018
doi:

Summary

Hypofunction الغدة اللعابية نتيجة متكررة للعلاج بالإشعاع وأمراض المناعة الذاتية. التقييم استنساخه من وظيفة الغدة اللعابية في نماذج الماوس لهذه الأمراض تحديا تقنيا. وهنا يتم وصف طريقة بسيطة لقياس دقيق واستنساخه لإنتاج اللعاب في الفئران.

Abstract

المرضى الذين يعانون من المتلازمة في سيورغن، أحد أمراض المناعة الذاتية التي تؤثر في إفرازات الغدد، تطوير التهاب الغدة اللعابية وخفضت إنتاج اللعاب. وبالمثل، يتم إنتاج اللعاب لخطر شديد في المرضى الذين يتلقون العلاج الإشعاعي لسرطان الرأس والعنق. تسهيل فهم إمراضية المرض نماذج القوارض، وضعت لتقليد هذه الشروط السريرية، والسماح لوضع استراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، القدرة على دقة، وتكاثر، ومرارا وتكرارا قياس وظيفة الغدة اللعابية في نماذج حيوانية أمر بالغ الأهمية. وبناء على الإجراءات المذكورة سابقا في الأدب، وضعت أسلوب يفي بهذه المعايير وكان يستخدم لتقييم وظيفة الغدة اللعابية في الفئران. ميزة إضافية لهذا الأسلوب الجديد هو أنه يتقن بسهولة، وقد تباين بين المشغل صغيرة. يتم تقييم الدالة الغدة اللعابية كمبلغ (الوزن أو الحجم) أو معدل اللعاب تنتج استجابة للتحفيز pilocarpine (مل/دقيقة). تجمع اللعاب مصدر جيد لتحليل محتوى البروتين، وتركيزات الغلوبولين المناعي، والجزيئات الحيوية الأخرى.

Introduction

تنتج الغدد اللعابية اللعاب في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات العصبية والميكانيكية1. ويجري من خلال النظام العصبي متعاطفة والجهاز السمبتاوي مستقبلات ادريناليه واتروبين في الغدة المحفزات. بيلوكاربيني هو عامل اتروبين، الفقرة–مقلدات الذي يعمل أساسا على المستقبلات المسكارينيه. في الغدة اللعابية، فإنه يحفز إنتاج اللعاب بالنيابة على مستقبلات أستيل المسكارينيه M31. مؤشرا لقدرة الغدد اللعابية للاستجابة لتحفيز إنتاج اللعاب بعد الإدارة pilocarpine ويستخدم عادة كمقياس لوظيفة الغدة اللعابية.

القياس الدقيق لإنتاج اللعاب أمر بالغ الأهمية في دراسة أمراض الغدة اللعابية بما في ذلك متلازمة في سيورغن2 وإصابة الإشعاع عقب الرأس والرقبة علاج السرطان3. وقد وضعت عدة طرق مختلفة لقياس إنتاج اللعاب في القوارض. وتشمل هذه كانوليشن مباشرة من القناة اللعابية مطرح4، وجمع من اللعاب من تجويف الفم تحت فراغ5، وجمع باستخدام الزجاج الشعيرات الدموية6 أو7،ميكروبيبيتي8، 9-المباشر يوفر كانوليشن للقناة اللعابية اللعاب أكثر دقة ونقية. ومع ذلك، هذا إجراء تحديا من الناحية التقنية، ويحول دون إمكانية التسبب في إصابة الأقنية مجموعات اللعاب المتكررة من الحيوان نفسه. جمع اللعاب تحت فراغ يمكن أن يؤدي إلى نتائج متغير بسبب جفاف اللعاب من الأنبوب. زيادة مبالغ هذه الخسارة في الفئران مع انخفاض اللعاب. الزجاج الشعيرات الدموية تسمح جمع اللعاب للتحاليل اللاحقة، ولكن يمنع التغييرات في لزوجة اللعاب يفرز في حالة المريضة ملء الكفء شعري. علاوة على ذلك، محاولة اكتساح تجويف الفم لجمع بقايا اللعاب يمكن أن تؤدي إلى إصابات. الأسلوب بيبيت يسمح لمجموعة كاملة، والمشغل نفسه، أنها متسقة ملحوظ بين التجارب. ومع ذلك، لأسباب غير معروفة، هذا الأسلوب يظهر تباينا كبيرا بين مختلف العاملين. ولذلك، تسمح بإجراء مقارنات مناسبة، يصبح من المحتم أن المشغل نفسه ينفذ جميع التجارب ذات الصلة بمشروع معين. ومن الواضح أن هذا يمثل عائقا رئيسيا لمختبر.

ووضعت إجراء للتغلب على هذه المشكلات، أن يجمع بين أساليب جمع اللعاب تستخدم للبشر والقوارض. طريقة مسحه، الموصوفة أدناه لقياس حجم اللعاب الناجم عن بيلوكاربيني هو بسيط، واستنساخه، لا تتأثر بالمشغل، ويمكن أن يؤديها مرارا وتكرارا في الحيوان نفسه. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح جمع اللعاب للتحاليل اللاحقة من البروتينات المناعية أو الجزيئات الحيوية الأخرى.

Protocol

وأقر البروتوكول، المذكورة أدناه برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة وأنه يتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها “المعاهد الوطنية للصحة”. جميع البيانات الواردة في هذا التقرير تم إنشاؤها بواسطة استخدام الفئران الإناث التي كانت الأسابيع 10-12 من العمر. واستخدمت السلالات التالية م?…

Representative Results

في النظم النموذجية التجريبية الماوس، يتم استخدام القدرة على إنتاج اللعاب استجابة للتحفيز بيلوكاربيني كمؤشر لوظيفة الغدة اللعابية. في الفئران الإناث C57BL/6 عمره 11 أسبوع تقاس طريقة مسحه إنتاج اللعاب. الشكل 1A، يتم التعبير عن النتائج بكمية اللعاب (mg) جمعت بعد ?…

Discussion

إنتاج اللعاب هو عملية معقدة، ويتأثر بعوامل عديدة. ولذلك، يمكن قياس وظيفة الغدة اللعابية في الحيوانات المختبرية تحديا. تحديا إضافيا أن القياسات المتكررة لوظيفة الغدة اللعابية في الحيوان نفسه المطلوب لإثبات ظهور المرض أو إظهار الاسترداد بعد العلاج.

الأسلوب مسحه الموصوفة في…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة منحة من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحوث (DE025030).

Materials

Chemicals for saliva collection
Pilocarpine hydrochloride Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA B21410 Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC
Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Mix solution Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.
Zetamine (Ketamine hydrochloride) Vet One, Boise, Idaho, USA C3N VT1 Stock is 100 mg/mL
Anased (Xylazine) Med-Vet International, Mettawa, IL, USA RXANASED-20 Stock is 20 mg/mL
Isotonic sterile saline Vet One, Boise, Idaho, USA 501032 Used as diluent
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) Henry Schien, Dublin, OH, USA 48272 Used to prevent eyes from drying during the procedure
Name Company Catalog Number Comments
Materials for saliva collection
SalivaBio Children's swab Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA N/A Individually wrapped swabs
50 mL polypropylene tubes VWR, Radnor, PA, USA 89004-364 Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.
Microcentrifuge tubes 0.6 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-290 Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles
Microcentrifuge tubes 2 mL VWR, Radnor, PA, USA 87003-298
Insulin Syringes with permanently attached needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 324702
18 gauge regular bevel needles Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 305195
Sterile scalpel blade #11 Integra York Inc PA, USA 4-311
Microdissecting forceps Roboz, Gaithersburg, MD, USA RS-5139 Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length
Label tape Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA sc-224487
3 channel timer Amazon.com, Seattle, WA, USA B06W2KCYVN
Analytical Balance Mettler Toledo, Columbus OH, USA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction
LPS Invivogen, San Deigo, CA, USA tlrl-b5lps Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip
Imject Alum adjuvant Thermo Scientific 77161 Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse
Rabbit anti-Ro52 antiserum Generated in lab Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals/ Kits for saliva analyses
Salivary lysozyme estimation
EnzChek Lysozyme Assay Kit Molecular Probes, Eugene, OR, USA E-22013 Used as per manufacturer's instructions
Name Company Catalog Number Comments
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA
Mouse IgA Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 0106-01 Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL
Goat anti- mouse IgA unlabeled Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-01 Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer
Goat anti- mouse IgA HRP Southern Biotech, Birmingham, AL, USA 1040-05 Detection antibody used at 1:4000 dilution
TMB substrate Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA 555214 Used as per manufacturer's instructions
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates Thermo Scientific, Rochester, NY, USA 3855
Name Company Catalog Number Comments
Salivary protein estimation
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate BioRad, Hercules, CA, USA 5000006 For protein estimation as per manufacturer's instructions

References

  1. Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
  2. Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
  3. Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
  4. Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
  5. Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
  6. Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
  7. Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
  8. Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
  9. Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
  10. Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
  11. Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
  12. Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
  13. Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
  14. Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).

Play Video

Cite This Article
Bagavant, H., Trzeciak, M., Papinska, J., Biswas, I., Dunkleberger, M. L., Sosnowska, A., Deshmukh, U. S. A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice. J. Vis. Exp. (131), e57203, doi:10.3791/57203 (2018).

View Video