침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.
Sjögren의 증후군, 전 분 비에 영향을 미치는 면역 질환 환자는 침 샘 염증을 개발 하 고 타 액 생산을 감소 했습니다. 마찬가지로 타 액 생산 머리와 목 암에 대 한 방사선 치료를 받은 환자에서 심각 하 게 손상 됩니다. 설치류 모델, 이러한 임상 조건 모방 개발 질병 pathogenesis의 이해를 촉진 하 고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 허용. 따라서, 정확 하 게, reproducibly, 그리고 반복적으로 동물 모델에서 침 샘 기능을 측정 하는 능력은 중요 합니다. 문학에서 설명한 이전 절차에 건물, 메서드는 이러한 기준을 충족 하 고 쥐에 있는 침 샘 기능을 평가 하는 데 사용 했다 개발 되었다. 이 새로운 방법의 추가적인 이점은 그것 쉽게 마스터 하 고는 작은 간 연산자 변화입니다. 침 샘 기능 (무게 또는 양) 또는 pilocarpine 자극에 대 한 응답에서 생산 하는 타 액의 속도 (mL/min)로 평가 됩니다. 수집 된 타 액 단백질 콘텐츠, 면역 글로불린 농도, 및 다른 생체 분석에 대 한 좋은 소스입니다.
침 샘 침 다양 한 신경 및 기계적 자극1에 대 한 응답을 생성합니다. 자극에 선 아드레날린 및 해 수용 체 교감 및 부 교감 신경 신경 시스템을 통해 수행 됩니다. Pilocarpine muscarinic 수용 체에 우위 하 게 작동 해, 파라 sympathomimetic 에이전트입니다. 침 샘에 그것은1M3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체에 행동에 의해 타 액의 생산을 유도합니다. Pilocarpine 관리에 따라 타 액 생산 자극에 응답 하는 침 샘의 능력의 지표 이며 침 샘 기능의 측정으로 상용 된다.
타 액 생산의 정확한 측정은 Sjögren의 증후군2 등 방사선 상해 다음 머리와 목 암 치료3침 샘 질환의 연구에 중요 합니다. 여러 가지 다른 방법은 설치류에 타 액 생산을 측정 하기 위해 개발 되었습니다. 4배설 침 덕트, 진공5, 아래 구강에서 타 액의 수집 그리고 유리 모 세관6 또는 micropipette7,8, 를 사용 하 여 컬렉션의 직접적인 cannulation 포함 됩니다. 9. 직접 cannulation 침 덕트의 가장 정확 하 고 순수한 타 액을 제공 합니다. 그러나, 이것은 기술적으로 도전적인 절차, 그리고 ductal 상해를 일으키는 원인이 되기를 위한 잠재력 같은 동물에서 반복적인 침 컬렉션 걸로 하겠습니다. 진공에서 타 액을 수집 튜브에서 타 액의 건조 변수 결과 발생할 수 있습니다. 이 감소는 감소 된 타 액 분 비와 쥐에 더 과장 된다. 그러나 유리 모 세관 후속 분석을 위해 타 액의 컬렉션, 병에 걸린 상태에서 분 비 하는 타 액의 점도 변화는 모 세관의 효율적인 충전을 방지 하는. 또한, 잔여 타 액을 수집 구강 청소 하려고 부상으로 이어질 수 있습니다. 피펫으로 메서드는, 완전 한 컬렉션에 대 한 수 있습니다 하 고 같은 연산자에 대 한 그것은 눈에 띄게 실험 사이. 그러나, 알 수 없는 이유로이 방법은 다른 연산자 사이의 중요 한 변화를 보여줍니다. 따라서, 적절 한 비교를 허용 하려면 동일한 연산자는 특정 프로젝트와 관련 된 모든 실험을 수행 필수적 된다. 명확 하 게,이 실험실을 위한 중요 한 불리를 나타냅니다.
이러한 문제를 해결 하려면 프로시저 결합 타 액 수집 방법 인간과 설치류에 대 한 사용 개발 되었다. Pilocarpine 유도 침 볼륨 측정에 대 한 아래 설명 하는 면봉 방법을 간단 하 고, 재현성, 연산자에 의해 영향을 받지 이며 같은 동물에 반복적으로 수행할 수 있습니다. 또한, 단백질, 면역 글로불린, 또는 다른 생체의 후속 분석을 위해 타 액을 수집 하는 수 있습니다.
타 액 생산은 복잡 한 프로세스 이며 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. 따라서, 실험실 동물에 침 샘 기능을 측정 하는 것은 도전 될 수 있습니다. 추가 도전 침 샘 기능 같은 동물에서의 반복된 측정은 질병의 발병을 설정 하거나 복구 치료 다음과 설명 필요입니다.
이 보고서에 설명 된 면봉 메서드는 데이터를 표현 하기 위해 여러 옵션을 수행할 수 기술적으로 간단 하다. ?…
The authors have nothing to disclose.
연구는 국립 보건원, 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (DE025030)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Chemicals for saliva collection | |||
Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials for saliva collection | |||
SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
Salivary lysozyme estimation | |||
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Salivary protein estimation | |||
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |