تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات
Summary
هذا أسلوب تحديد البروتينات رواية يتفاعل الحمض النووي في المكاني مستهدفة محددة، تعتمد على التقاط تسلسل على حدة من الكروماتين كروسلينكيد للتحاليل اللاحقة البروتين. لا معرفة مسبقة عن إمكانية ربط البروتينات، ولا خلية إدخال تعديلات مطلوبة. وضعت في البداية للخميرة، التكنولوجيا قد تم تكييفها لخلايا الثدييات.
Abstract
التقاط التهجين من البروتينات المرتبطة بلونين للتكنولوجيا البروتيوميات (هيككاب) وضعت في البداية للكشف عن تفاعلات البروتين الحمض النووي رواية في الخميرة. وهو يسمح تحليل للمنطقة المستهدفة من الفائدة دون الحاجة إلى معرفة مسبقة حول البروتينات المحتمل منضمة إلى المنطقة المستهدفة. هذا، من الناحية النظرية، يسمح هيككاب استخدامها لتحليل أي منطقة الجينوم بالفائدة، ويوفر المرونة الكافية للعمل في نظم خلية مختلفة. ليس المقصود من هذا الأسلوب لدراسة مواقع الربط لعوامل النسخ المعروفة، مهمة أكثر ملاءمة “الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن” (شريحة) وأساليب مثل الرقائق. قوة هيككاب تكمن في قدرتها على استكشاف مناطق الحمض النووي التي يوجد محدودة أو أي علم عن البروتينات منضمة إليها. قد يكون أيضا وسيلة مريحة لتجنب التحيز (موجودة في أساليب مثل رقاقة) عرضته تخصيب الكروماتين على أساس البروتين باستخدام الأجسام المضادة. يحتمل أن تكون، هيككاب يمكن أن تكون أداة قوية للكشف عن تفاعلات الحمض النووي-البروتين رواية حقاً. وحتى الآن، التكنولوجيا الغالب طبق لخلايا الخميرة أو تسلسل تكرار نسخة عالية في خلايا الثدييات. ولكي تصبح أداة قوية ونحن نتصور، حاجة هيككاب النهج الأمثل لكفاءة التقاط المكاني نسخة واحدة في خلايا الثدييات. نقدم هنا، لدينا تكييف الخميرة الأولية هيككاب القبض على بروتوكول لخطوط الخلايا البشرية، وتبين أن مناطق الكروماتين نسخة واحدة يمكن أن تكون معزولة كفاءة مع هذا البروتوكول المعدل.
Introduction
خلال العقد الماضي، قد شهدت تحسن كبير في تسلسل التكنولوجيات، والسماح لدراسة طائفة واسعة من مورثات في عدد كبير من العينات، ومع قرار مذهل. وقد قدم الكونسورتيوم موسوعة عناصر الحمض النووي (ترميز)، جهدا مؤسسية متعددة على نطاق واسع تتصدره المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشري من “المعاهد الوطنية للصحة”، ثاقبة عوامل النسخ كيف الفردية وربط البروتينات التنظيمية الأخرى والتفاعل مع الجينوم. وتتميز الجهد الأولى تفاعلات الحمض النووي-البروتين محددة، كما يقيمها الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة) ل البروتينات الحمض النووي ملزم المعروفة ما يزيد على 1001. أساليب بديلة مثل الدناز footprinting2 وفورمالدهايد ساعد عزل العناصر التنظيمية (فير)3 كما استخدمت لتحديد مناطق محددة من الجينوم تتفاعل مع البروتينات، ولكن مع الحد من الواضح أن لا تحدد هذه النهج التجريبي البروتينات المتفاعلة. وعلى الرغم من الجهود المكثفة على مدى السنوات الماضية، برز لا تكنولوجيا تسمح كفاءة توصيف شامل لتفاعلات البروتين-الحمض النووي في الكروماتين، وتحديد وتقدير حجم البروتينات المرتبطة الكروماتين.
ولتلبية هذه الحاجة، طورنا نهجاً جديداً ونحن وصفته بالبروتينات Hybridization Capture of Chromatin-Associated للبروتينات (هيككاب). وضعت في البداية في الخميرة4،5،6، النهج الذي يعزل كروسلينكيد مناطق الكروماتين الفائدة (مع البروتينات منضم) باستخدام التقاط التهجين الخاصة بالتسلسل. بعد عزل مجمعات البروتين-الحمض النووي، يمكن استخدام نهج مثل الطيف الكتلي لوصف مجموعة البروتينات منضمة إلى تسلسل الفائدة. وهكذا، يمكن اعتبار هيككاب كما نهج غير منحاز للكشف عن تفاعلات الحمض النووي-البروتين الرواية، بمعنى أنها لا تعتمد على الأجسام المضادة، وأدري تماما عن البروتينات التي يمكن العثور عليها. وهناك نهج أخرى قادرة على الكشف عن رواية البروتينات يتفاعل الحمض النووي7، ولكن أشد الاعتماد على أساليب مثل رقاقة8،9،10،11،بلازميد الملاحق12، 13،14، أو المناطق ب إعداد نسخة عالية15. وفي المقابل، هيككاب يمكن تطبيقها على مناطق متعددة ونسخة واحدة، وأنها لا تتطلب أي معلومات مسبقة عن البروتينات في المنطقة. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن بعض الطرق المذكورة أعلاه قد معدلة ميزات قيمة، لا سيما تجنب الحاجة للبروتين الحمض النووي crosslinking ردود فعل، ميزة فريدة من نوعها من هيككاب أنه يمكن تطبيقها على مناطق نسخة واحدة في الخلايا، ودون أي علم مسبق حول بروتينات ملزمة المفترضة، أو الأجسام المضادة المتاحة.
عند هذه النقطة، وطبق أساسا لتحليل مختلف مناطق الجينوم في الخميرة4،،من56هيككاب، واستخدمت مؤخرا لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين في ألفا-الساتل الحمض النووي، وهي منطقة تكرار في المجين البشري16. كجزء من عملنا المستمر، ونحن قد تكيفت النهج التقاط التهجين الذي وضعت في البداية لخميرة الكروماتين تكون قابلة للتطبيق لتحليل الخلايا البشرية، والحاضرة هنا بروتوكول تعديل يسمح لالتقاط الانتقائي لهدف واحد-نسخة المناطق في الجينوم البشري بكفاءات مماثلة إلى أن الدراسات الأولية في الخميرة. يسمح هذا البروتوكول الجديد الأمثل الآن تكييف واستخدام التكنولوجيا لاستجواب تفاعلات البروتين-الحمض النووي عبر المجين البشري، واستخدام الطيف الكتلي أو غير ذلك من النهج التحليلي.
من المهم أن نؤكد على أن الأسلوب هيككاب هو المقصود لتحليل مناطق مستهدفة محددة، وليست مناسبة لإجراء تحاليل على نطاق الجينوم. التكنولوجيا مفيد بشكل خاص عند التعامل مع المناطق التي توجد معلومات قليلة جداً حول البروتينات المتفاعلة، أو عندما هو المطلوب إجراء تحليل متعمق أكثر شمولاً للبروتينات المتفاعلة في موضع جينوم محددة. هيككاب يهدف إلى الكشف عن الحمض النووي ملزم البروتينات ولكن لا تميز بدقة مواقع ربط بروتين معين في الحمض النووي. المنهجية في تنفيذه بشكله الحالي، لا توفر معلومات حول تسلسل الحمض النووي ملزم أو زخارف للبروتينات الفردية. ولذلك، فإنه لطيف يكمل التكنولوجيات الموجودة مثل عدم التدخل، وقد تسمح بتحديد البروتينات ملزمة جديدة في مناطق المجين حددها تحليلاً أولياً فير.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد هيككاب الطريقة الموضحة هنا العديد من الميزات الفريدة التي تجعل من نهج قوية للكشف عن التفاعلات بين الحمض النووي وإلا سيظل بعيد المنال. طبيعة العملية يعطي هيككاب المرونة اللازمة للعمل في مختلف الكائنات الحية ومناطق من الجينوم. وطريقة، ومع ذلك، يحتوي على العديد من القيود التي سينظر فيها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعم هذا العمل P50HG004952 منح المعاهد الوطنية للصحة و R01GM109099 إلى mo.
Materials
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
- Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
- Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
- Lambert, J. -. P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
- Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
- Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
- Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
- Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
- Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).
