Summary

Sıtma enfeksiyon sırasında hücre dışı vezikül ile değerlendirilmesi

Published: February 14, 2018
doi:

Summary

Bu çalışmada, enfekte Plasmodium falciparum eritrositler tarafından yayımlanan ekstraselüler veziküller (EVs) rolünü araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Özellikle, endotel hücreleri ile EVs etkileşimleri odaklanmak.

Abstract

Sıtma bir yaşamı tehdit eden hastalık Plasmodium parazitler tarafından neden, P. falciparum ile en yaygın Afrika kıtasında ve en sıtma ile ilgili boyunca genel olarak varlık. Doku, vasküler disfonksiyon ve inflamatuar yanıt parazit tutma gibi birçok etkene sıtma enfekte kişilerde hastalığın evrim etkilemek. P. falciparum-virüslü kırmızı kan hücreleri (iRBCs) yayın çeşitli türde Patogenez ve hücresel iletişim parazitler ve ev sahibi arasında arabuluculuk kargo molekülleri içeren küçük hücre dışı veziküller (EVs). EVs verimli bir şekilde hangi onlar işlevlerine modüle hücreleri tarafından alınır. Burada EVs rolde parazit-ana etkileşimler adrese stratejileri tartışmak. İlk olarak, biz bir yeşil hücre bağlayıcı boya kullanarak etiketleme ve endotel hücreleri tarafından EV içselleştirilmesi izlemek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. İkinci olarak, biz geçirgenliği endotel hücre monolayer fluorescently etiketli dextran kullanarak ölçmek için basit bir yol raporu. Son olarak, biz küçük kodlamayan RNA molekülleri endotel hücre işlevindeki rolünü araştırmak nasıl göstereceğim.

Introduction

Dünya Sağlık Örgütü göre 2015 yılında dünya çapında sıtma 212 milyon yeni vaka vardı ve yaklaşık 429,000 kişi öldü, esas olarak yaş1beş yaş altı çocuklar. Genellikle vasküler disfonksiyonu ile ilişkili olan, ağır hastalıklar için önde gelen mekanizmalar kötü tanımlanmış2kalır. Plasmodium– iRBCs küçük bi-lipid membran küreler ekstraselüler veziküller (EVs) bilinen salgılar. Bu EVs potansiyel enfeksiyon enfeksiyon süreci ve konak immün yanıt ilgili bilinir; Ancak, az sıtma enfeksiyon3sırasında bu küçük veziküller özdeş işlevini hakkında bilinir. Bu iki önemli roller oynamak mümkündür: bir yandan, makrofajlar4,5; aktive ederek patogenezinde katkıda ve öte yandan, hücresel iletişim parazitler arasında parazitler ve ana bilgisayar6,7arasında arabuluculuk. Aslında, parazitler proteinler veya nükleik asitler birbirleriyle EVs üzerinden aktarabilirsiniz. Örneğin, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virülans faktörü Serum Resistance-Associated (SRA) aktarabilir ve diğer T. brucei ve ana bilgisayar eritrositler8hedefleyebilirsiniz. Ayrıca, P. falciparum– iRBCs arada her diğer nükleik asitler EVs içinde aktarma tarafından iletişim. Bu parazitler optimize etmek ve onun büyüme eşitlemek sağlar. Aslında, EVs, gametocyte dönüşüm büyük düzenleyici olmak ve bu nedenle iletim sahne7düzenlenmesi için katkıda bulunmak.

Sadece EVs parazitleri düzenleyen, onlar da parazit ana bilgisayar etkileşimi aracılık. Biz son zamanlarda EVs iRBCs gelen insan endotel hücreleri tarafından gerçekleştirilen ana bilgisayar kaynaklı mikroRNA (miRNAs; 21-25 nükleotit9aralığındaki küçük RNA türü) içeren keşfetti. EVs miRNAs Ago2 ile karmaşık istikrarlı bir form (RNA kaynaklı damping üye karmaşık), hangi bir kez alıcı hücrelere teslim kabil özellikle gen ifadesinin susturulması ve hücre10bariyer özelliklerini etkileyen. Standart protokolleri EVs işlevi araştırmak için geliştirilmiştir. Burada, biz ilk tarif onların alımını alıcı hücreleri tarafından araştırmaya EVs floresan etiketlemeyi sağlayan bir protokol. Buna ek olarak, confocal mikroskop kullanarak, bu EV’ın kaderi hücre içindeki izlemek mümkündür. Çeşitli floresan boyalar EVs izlemek için kullanılabilir. Amin-reaktif boya, 5-(and-6) Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) ve Calcein-AM olmak floresan bir kez veziküller içinde. Daha parlak ve daha düzgün bir sinyal verir, çünkü biz amfifilik etiket, PKH, kullanmayı tercih eder. Bu yaklaşım EVs ve alıcı hücreler arasındaki etkileşimleri anlamak için önemli bilgiler sağlar. Bazı durumlarda EVs hücreleri yüzeye bağlamak iken, bazı veziküller hızla alınır. Alımı EVs hangi onlar yasal işlevlerini uygularlar hücrelere onların yükleri teslim.

Burada, endotel hücreleri vitro bariyer fonksiyonu bir floresan dextran hücresel monolayer aracılığıyla transfer miktarının ölçmek için bir protokol açıklayın. Daha hassas tarayıcıları gibi radiolabeled işaretleri kullanılabilir. Ancak, onlar için özel güvenlik önlemleri gerektirir. Vitro bariyer fonksiyonu gibi sıkı bağlantı bütünlüğü ölçen transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ), ölçmek için diğer deneyleri adlı biri yok. Sonunda ZO-1, sıkı kavşak protein ayirt tarafından görüntülenmesi iyi10olarak sıkı kavşak dürüst değerlendirme sağlar. EVs potansiyel düzenleyici özelliği ile birkaç yükleri içeren karmaşık ve türdeş olmayan varlıklar olduğundan, alıcı hücreye üzerindeki etkisini incelemek için belirli bir RNA overexpress yararlıdır. Bu nedenle, ayrıca faiz10miRNA ifade istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için amaçlayan bir iletişim kuralını tanımlar.

Protocol

İnsan RBCs Swissethics (swissethics.ch) yönergeleri doğrultusunda sağlıklı bağış kan elde. Not: P. falciparum parazit kültür (3D 7) ve EV üretim daha önce Mbagwu tarif edildi ve ark. 11 P. falciparum insan bir patojen olduğundan, işleme için yerel düzenlemelere bakın. Kültürler tüm steril tutulmalıdır zaman. 1. Floresans EVs etiketleme Not: Aşağıdaki yordam, stabil…

Representative Results

Burada, konak hücreleri ile EVs etkileşimleri araştırmak için iletişim kurallarını açıklar. Fluorescently etiketli EVs alımını confocal mikroskobu (şekil 1) tarafından kontrol edilmektedir. EVs kuluçka zamanla alımını izlemek için optimize edilebilir ancak endotel hücreleri verimli EVs götür. Bir daha iyi yerelleştirme EVs için hücrelere, aktin phalloidin ile leke. Sonra hangi üst kısmında bir monolayer endotel hücrelerinin büy?…

Discussion

Çeşitli parazitler, Toxoplasma, Trypanosoma, LEISHMANIA ve Trikomonas gibi EVs virüslü konak hücre sürümü tetikler. Patojenler bağlı olarak yayımlanan EVs konak immün yanıt modüle veya hücresel iletişim parazitler6arasında arabuluculuk. Henüz, bu küçük veziküller sıtma hastalığı için nasıl katkıda bulunduğunu düşündüren çok az kanıt var. Burada, EVs fonksiyonu Plasmodium enfeksiyon sırasında araştırmak için çeşitli yollar anlatmıştık. Örneği…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışmada mali kısmen tıbbi ve biyolojik araştırma (PYM için) Gottfried ve Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (için MW ve PYM) ve araştırma havuzu Fribourg Üniversitesi (PYM için) Novartis Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ek hibe İsviçre hükümetinin mükemmellik burs (için KAFİLE ve SM) yabancı bilim adamları için içerir. Isabelle Fellay ve Solange Kharoubi Hess teknik destek için teşekkür ederiz.

Materials

PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Diluent C Sigma-Aldrich G8278
poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
PBS ThermoFisher – Gibco 10010023
Phalloidin CF594 Biotium #00045
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570
ProLong Gold Antifade Mountant ThermoFisher P36934
Rhodamine B isothiocyanate–Dextran ThermoFisher R9379-250MG
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Falcon 353095
Endothelial Cell Growth Medium MV Promocell C-22020
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P9620-10ML
MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit Biovision K300-500
hexadimethrine bromide Sigma-Aldrich 107689-10G
MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a Sigma-Aldrich HLMIR0583
MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles Sigma-Aldrich NCLMIR001
MISSION Lenti microRNA, Human Sigma-Aldrich NCLMIR0001
Leica TCS SP5 Leica Microsystems
miRNeasy mini Kit Qiagen 217004
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions ThermoFisher 4366597
hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns ThermoFisher 001141
U6 snRNA ThermoFisher 001973
TaqMan Universal Master Mix II, with UNG ThermoFisher 4440038
StepOnePlus Real-Time PCR System ThermoFisher 4376600

References

  1. WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
  4. Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
  5. Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
  6. Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
  7. Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
  8. Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
  9. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  10. Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
  11. Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
  12. Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
  13. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
  14. Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  15. French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
  16. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
  17. Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
  18. Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
  19. Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).

Play Video

Cite This Article
Andrea Hernández-Castañeda, M., Mbagwu, S., Babatunde, K. A., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection. J. Vis. Exp. (132), e57067, doi:10.3791/57067 (2018).

View Video