Auswertung der extrazellulären Vesikel Funktion im Malaria-Infektion
Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.
Abstract
Malaria ist eine lebensbedrohliche Krankheit, verursacht durch Plasmodium -Parasiten, mit p. Falciparum als auf dem afrikanischen Kontinent verbreitet und verantwortlich für die meisten Malaria-Todesfälle weltweit. Mehrere Faktoren einschließlich der Parasit Sequestrierung in Geweben, vaskuläre Dysfunktion und Entzündungsreaktionen beeinflussen die Entwicklung der Krankheit bei Menschen mit Malaria infiziert. P. Falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBCs) lösen kleine extrazelluläre Vesikel (EVs), enthält verschiedene Arten von Fracht-Moleküle, die Pathogenese und zelluläre Kommunikation zwischen Parasiten und Host zu vermitteln. EVs werden effizient durch Zellen aufgenommen in denen sie ihre Funktion modulieren. Hier besprechen wir Strategien, um die Rolle der EVs in Parasit-Wirt-Interaktionen. Zunächst beschreiben wir eine einfache Methode für die Kennzeichnung und Nachverfolgung EV Internalisierung von Endothelzellen, mit einem grünen Zelle Linker Farbstoff. Zum anderen berichten wir über eine einfache Methode zur Durchlässigkeit über eine Monolage Endothelzellen messen mithilfe von Eindringmittel beschrifteten Dextran. Schließlich zeigen wir, wie die Rolle der kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle in Endothelzellen Funktion zu untersuchen.
Introduction
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation gab es 212 Millionen neue Fälle von Malaria im Jahr 2015 weltweit und rund 429.000 Menschen starben, vor allem Kinder unter fünf Jahren Alter1. Die Mechanismen, die schwere Krankheit, die oft mit vaskuläre Dysfunktion assoziiert wird, bleiben unklar2. Plasmodium– iRBCs absondern, kleine Bi-Lipidmembran Sphären als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt. Es ist bekannt, dass diese EVs den Infektionsprozess und die Host-Immunantwort auf eine Infektion potenziell relevant sind; jedoch ist wenig bekannt über die genaue Funktion von diesen kleinen Vesikeln in Malaria-Infektion3. Es ist möglich, dass sie zwei wichtige Rollen spielen: auf der einen Seite könnte sie zur Pathogenese beitragen, durch die Aktivierung von Makrophagen4,5; und auf der anderen Seite könnten sie zellulare Kommunikation zwischen Parasiten und zwischen Parasiten und Host6,7vermitteln. In der Tat können Parasiten Proteinen oder Nukleinsäuren untereinander über EFD übertragen. Z. B. Trypanosomen Trypanosomen Rhodesiense EVs Virulenzfaktor Serum Resistance-Associated (SRA) zu übertragen und kann gezielt andere T. Trypanosomen und Host Erythrozyten-8. Darüber hinaus kommunizieren p. Falciparum– iRBCs zwischen einander durch die Übertragung von Nukleinsäuren im EFD. Dadurch können die Parasiten zu optimieren und das Wachstum zu synchronisieren. In der Tat EVs möglicherweise wichtiger Regulator der Gametocyte Umwandlung, und somit dazu beitragen, die Regelung der Übertragung Stufe7.
Nicht nur tun EVs regulieren die Parasiten, sie vermitteln auch Parasit-Wirt-Interaktionen. Wir haben kürzlich entdeckt, dass EVs aus iRBCs Host-abgeleitete Micro-RNAs (MiRNAs; kleine RNA-Spezies im Bereich von 21-25 Nukleotide9) enthalten, die von menschlichen Endothelzellen aufgegriffen wurden. Die MiRNAs in der EVs bilden eine stabile komplexe mit Ago2 (ein Mitglied des RNA-induced silencing complex), die einmal an den Empfängerzellen geliefert ist in der Lage, gezielt Genexpression zum Schweigen zu bringen und die Auswirkungen auf die Barriereeigenschaften der Zellen10. Standard-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktion des EFD zu untersuchen. Hier beschreiben wir zunächst ein Protokoll, das fluoreszierende Kennzeichnung von EVs zu untersuchen, deren Aufnahme durch Empfängerzellen ermöglicht. Mithilfe einer confocal Mikroskop ist es darüber hinaus möglich, die EV Schicksal innerhalb der Zelle zu verfolgen. Einige Leuchtstofffärbungen können verwendet werden, um EVs zu verfolgen. Die Amin-Reaktivfarbstoffen, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) und Calcein-AM werden Leuchtstoffröhren einmal im Inneren der Bläschen. Wir bevorzugen die amphiphile Label, PKH, weil es ein heller und gleichmäßiger Signal gibt. Dieser Ansatz bietet wichtige Informationen, um die Wechselwirkungen zwischen EVs und Empfängerzellen verstehen. Während in einigen Fällen EVs an der Oberfläche der Zellen zu binden, werden einige Bläschen schnell aufgegriffen. Nach Aufnahme liefern EVs ihre Fracht an den Zellen, in denen sie ihre regulatorische Funktionen ausüben.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Barriere-Funktion der Endothelzellen in-vitro- messen durch die Übertragung von einem fluoreszierenden Dextran durch eine zelluläre Monolage zu quantifizieren. Empfindlicher Tracer können z. B. radioaktiven Marker verwendet werden. Sie erfordern jedoch besondere Sicherheitsvorkehrungen für den Einsatz. Andere Tests bestehen, um die in-vitro- Barriere-Funktion wie Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER), zu messen, die engen Kreuzung Integrität misst. Schließlich visualisieren ZO-1, eine tight Junction Proteins durch Immunfluoreszenz ermöglicht Beurteilung der Widerstandsfähigkeit gegen enge Kreuzung als gut10. Da die EVs komplexen und heterogenen Entitäten enthält mehrere Ladungen mit möglichen regulatorischen charakteristisch sind, ist es sinnvoll, eine spezifische RNA um seine Wirkung auf die Empfängerzelle studieren overexpress. Deshalb definieren wir auch eine Protokoll, die darauf abzielt, stabilen Zelllinien mit dem Ausdruck der MiRNA Interesse10zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einige Parasiten, einschließlich Toxoplasma, Trypanosomen und Leishmanien Trichomonas auslösen die Freigabe der EVs von der infizierten Wirtszelle. Je nach Erreger können freigegebene EVs vermitteln zelluläre Kommunikation zwischen den Parasiten6bzw. der Host Immunantwort modulieren. Jedoch gibt es wenig Hinweise darauf, wie diese kleinen Bläschen zu Malaria Krankheit beitragen. Hier haben wir mehrere Möglichkeiten, um die Funktion des EFD bei Plasmodium Infektion untersuchen beschr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Novartis-Stiftung für medizinische und biologische Forschung (um PYM), der Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (für MW und PYM) und den Forschungspool der Universität Freiburg (um PYM) teilweise finanziell unterstützt. Weitere Beihilfen gehören die Schweizer Regierung Excellence Scholarships für ausländische Wissenschaftler (zur KAB und SM). Wir danken Isabelle Fellay und Solange Kharoubi Hess für technischen Support.
Materials
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher – Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit | Biovision | K300-500 | |
| hexadimethrine bromide | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions | ThermoFisher | 4366597 | |
| hsa-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, with UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
References
- WHO. . WHO Malaria Report 2015. , (2015).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Mantel, P. Y., Marti, M. The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites. Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).
- Couper, K. N., et al. Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation. PLoS Pathog. 6 (1), e1000744 (2010).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Regev-Rudzki, N., et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).
- Szempruch, A. J., et al. Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia. Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Mantel, P. Y., et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 7, 12727 (2016).
- Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria. Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).
- Schweitzer, K. M., et al. Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells. Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).
- Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. J Vis Exp. (98), (2015).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria. Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).
- Jambou, R., et al. Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions. PLoS Pathog. 6 (7), e1001021 (2010).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
