إنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج الجيني
Summary
في هذا البروتوكول، التي تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس داخل الخلايا Sf9 باكولوفيروس وتضخيمه في ثقافة خالية من المصل تعليق. المادة طافية تنقيته من الهيبارين التقارب اللوني ويتركز المزيد من تنبيذ فائق. هذا البروتوكول مفيد لإنتاج وتنقية باكولوفيروس لتطبيق العلاج بالجينات.
Abstract
وقد استخدمت تقليديا باكولوفيروس لإنتاج البروتين المؤتلف واللقاحات. ومع ذلك، في الآونة الأخيرة، باكولوفيروس تبرز كوسيلة واعدة لتطبيق العلاج بالجينات. هنا، هو باكولوفيروس تنتجها تعداء عابرة من بلازميد باكولوفيروس الحمض النووي (باكميد) في ثقافة ملتصقة من الخلايا Sf9. بعد ذلك يتم توسيع باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة خالية من المصل تعليق حتى يتم الحصول على وحدة التخزين المطلوبة. ثم أنه هو تنقيته من ثقافة طافية استخدام الهيبارين التقارب اللوني. فيروس طافية يتم تحميلها على العمود الهيبارين الذي يربط جزيئات باكولوفيروس في المادة طافية بسبب تقارب الهيبارين لتغليف باكولوفيروس بروتين سكري. العمود يتم غسلها مع مخزن مؤقت لإزالة الملوثات وهو الوتيد باكولوفيروس من العمود مع عازلة عالية-الملح. هو تضعف النذرة إلى بتركيز ملح متساوي التوتر وجسيمات باكولوفيروس زيادة تركيز استخدام تنبيذ فائق. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن أن تتركز تصل إلى 500-fold مع انتعاش 25% من الجزيئات المعدية باكولوفيروس. على الرغم من أن البروتوكول هو موضح هنا يدل على الإنتاج وتنقية باكولوفيروس من الثقافات ما يصل إلى 1 لتر، الأسلوب يمكن أن تكون زيادة في ثقافة تعليق نظام مغلق لإنتاج ناقل السريرية الصف لتطبيق العلاج بالجينات.
Introduction
باكولوفيروس يستخدم في المقام الأول لإنتاج البروتينات المؤتلف واللقاحات في ليبيدوبتيران فوجيبيردا سبودوبتيرا (Sf) 9 خلايا الحشرات باستخدام المؤتلف كاليفورنية أوتوجرافا مولتيكابسيد بوليهيدروسيس النووية الفيروسات (أكمنبف) 1 , 2 , 3 , 4. في الآونة الأخيرة، فإنه يبرز بوصفه وسيلة واعدة ل تطبيق العلاج الجيني5. من المعروف أن لديها انتحاء المضيف والأنسجة واسعة ويصيب كل هادئة وتكاثر الخلايا، هي غير ممرضة، وعدم الاندماج في المضيف كروموسوم4،،من56. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج باكولوفيروس في ثقافة خالية من المصل تعليق التي هي قابلة للتطوير، ويسمح لنظام مغلق التجهيز لإنتاج السريرية في المستقبل1.
النقاء للجسيمات باكولوفيروس أمر مهم لتحقيق توصيل فعالة مع التقليل من سيتوتوكسيسيتي7،،من89. يمكن أن تتركز باكولوفيروس تنبيذ فائق أو تدفق عرضية الترشيح (النموذجي) مع تأثير محدود على العدوى به. ومع ذلك، هذه الإجراءات ليس فقط تركيز جزيئات الفيروس ولكن أيضا الحطام الخلوية والبروتينات من Sf9 الثقافة والتي يمكن أن تكون سامة في المختبر (ملاحظة شخصية) وقد حمل التهاب أو استجابة مناعية عند استخدامها في فيفو. لتجنب هذا، خاصة عند استخدام عالية تتركز مخزونات الفيروس، يلزم باكولوفيروس المعدية تنقية وفصلها عن تلويث الجسيمات.
وأبلغ العديد من الأساليب لتنقية وتركيز باكولوفيروس ناقلات10،،من1112. النهج المتاحة، يسمح الهيبارين التقارب اللوني لمستوى عال خطوة واحدة لتنقية بتركيز منخفض من تلويث البروتينات12. الأسلوب الذي يستند إلى تحديد كبريتات heparan مستقبلات باكولوفيروس13،14. بعد تحميل المادة Sf9 خلية طافية على العمود والملزم باكولوفيروس، يمكن غسلها العمود مع المخزن المؤقت (متساوي التوتر) الفسيولوجية لإزالة الجسيمات تلويث فضفاضة منضم أو غير منضم. نظراً للربط إلى الهيبارين عكسها، يمكن التيد جسيمات باكولوفيروس مع المخزن مؤقت ملح عالية، التي تضعف فورا إلى تركيز الملح (متساوي التوتر) الفسيولوجية لمنع المنظمة من صدمة ناضح12. وعلاوة على ذلك، إنتاج باكولوفيروس، فضلا عن القبض على وشطف من العمود اللوني، يمكن أن يؤديها باستخدام عملية النظام المغلق الذي يتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب).
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتصنيع وتنقية، وتركيز باكولوفيروس المعدية باستخدام الفصل اللوني لتقارب والطرد المركزي. باختصار، نحن إنتاج باكولوفيروس من تعداء الخلايا Sf9 مع باكولوفيروس بلازميد الحمض النووي في الثقافة ملتصقة وتوسيع باكولوفيروس المعدية في ثقافة خالية من المصل تعليق. ونحن نق باكولوفيروس استخدام الهيبارين التقارب اللوني واستخدام تنبيذ فائق كخطوة أخيرة عالية التركيز متجه لتطبيق العلاج بالجينات.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف البروتوكول المعروضة هنا إنتاج باكولوفيروس في الخلايا Sf9 في ثقافة الوقف، وتنقية باكولوفيروس الهيبارين تقارب لوني باستخدام. المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول تعظيم العائد وتقليل المنظمة باكولوفيروس المعدية. يظهر هنا وينص البروتوكول تحقيق انتعاش تحسنت بشكل ملحوظ للجسيمات باكولوف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل هو تدعمها جزئيا من مؤسسة البحوث (الرشيد سينسيناتي للأطفال) التمويل الأولى لرائد ومنحة أساسية مبتكرة (ICG) يدعمه المركز الوطني “النهوض بالعلوم متعدية الجنسيات” من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم UL1 TR001425. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
