Производства и очистки бакуловирусы для применения генной терапии
Summary
В этом протоколе бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмида в Sf9 клетки и усиливается в культуре подвеска сыворотки бесплатно. Супернатант очищается хромотографией сродства гепарин и далее сосредоточена на ultracentrifugation. Этот протокол используется для производства и очистки бакуловирусы для генной терапии приложения.
Abstract
Бакуловирусы традиционно используется для производства рекомбинантных белков и вакцины. Однако совсем недавно, бакуловирусы становится перспективным вектор для генной терапии приложения. Здесь бакуловирусы производится переходных трансфекции бакуловирусы плазмидной ДНК (bacmid) в адэрентных культуры клеток Sf9. Бакуловирусы впоследствии расширены в Sf9 клеток в культуре сыворотки бесплатные подвески до получения нужного тома. Затем он очищается от культуры супернатанта, используя хромотографию сродства гепарина. Вирус супернатанта загружается на столбце гепарина, который связывает частицы бакуловирусы в надосадке благодаря близости гепарина для бакуловирусы окутывать гликопротеина. Столбце вымывается с буфером для удаления загрязнений и бакуловирусы этого eluted из столбца с высоким содержанием соли буфера. Элюата разводят в изотоническом концентрации соли и бакуловирусы частиц дальнейшего концентрируется с помощью ultracentrifugation. С помощью этого метода, бакуловирусы может быть сосредоточено до 500-fold с 25% восстановления инфекционных частиц. Хотя протокол, описанные здесь демонстрирует производства и очистки бакуловирусы от культур до 1 Л, метод может быть увеличен в закрытой системе подвески культуре производить клинико класса vector для генной терапии приложения.
Introduction
Бакуловирусы используется главным образом для производства рекомбинантных белков и вакцин в lepidopteran Spodoptera fugiperda (Sf) 9 насекомых клеток с помощью рекомбинантной californica Металловидка multicapsid ядерных polyhedrosis вирус (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. совсем недавно, она становится перспективным вектор для генной терапии приложения5. Это известно широкой хост и ткани тропизма, заражает покоя и пролиферирующих клеток, непатогенные и не интегрироваться в принимающей хромосомы4,5,6. Кроме того бакуловирусы могут быть произведены в сыворотки бесплатно подвеска культуры, которая является масштабируемой и позволяет для закрытой системы обработки для будущих клинических производства1.
Чистота бакуловирусы частиц имеет важное значение для достижения эффективного трансдукции при сведении к минимуму цитотоксичность7,8,9. Бакуловирусы может быть сконцентрирован на ultracentrifugation или тангенциальная фильтрация (TFF) с минимальным воздействием на его инфективности. Однако, эти процедуры не только сосредоточиться частицы вируса, но также сотовой мусора и белки от Sf9 культуры, которые могут быть токсичными в пробирке (личное наблюдение) и может вызвать воспаление или иммунного ответа при использовании в естественных условиях. Чтобы избежать этого, особенно когда с использованием высоко концентрированный запасов вируса, инфекционные бакуловирусы необходимо быть очищенной и отделены от загрязняющих частиц.
Были зарегистрированы несколько методов для очищения и концентрации бакуловирусы векторов10,,1112. Из имеющихся подходов гепарин аффинной хроматографии позволяет для единый этапа высокого уровня очистки с низкой концентрацией загрязняющих белки12. Метод основан на определении heparan сульфат как рецептора бакуловирусы13,14. После загрузки Sf9 клеток супернатант на столбец и привязка бакуловирусы, столбец можно мыть с физиологической (изотонические) буфера для удаления несвязанного или слабо связанного загрязняющих частиц. Поскольку привязки гепарина является обратимым, можно этого eluted бакуловирусы частицы с высокой соли буфер, который сразу же разбавляют в физиологические (изотонические) концентрации соли для предотвращения инактивации осмотическим шоком12. Кроме того производство бакуловирусы, а также захват на и элюции в столбце хроматографии, могут выполняться с использованием закрытой системе процесс, который совместим с текущей надлежащей производственной практики (cGMP).
Здесь мы предоставляем подробный протокол для производства, очистки и концентрация инфекционных бакуловирусы, используя хромотографию сродства и центрифугирования. Кратко мы производим бакуловирусы по transfection клеток Sf9 с бакуловирусы плазмидной ДНК в адэрентных культуре и далее расширять инфекционных бакуловирусы сыворотки бесплатно подвеска культуры. Мы очистить бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарин и использовать ultracentrifugation в качестве последнего шага высоко сконцентрировать вектор для генной терапии приложения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленные здесь описывает производства бакуловирусы в Sf9 клеток в культуре подвеска и очистки бакуловирусы используя хромотографию сродства гепарина. Параметры, используемые в настоящем Протоколе максимальной урожайности и свести к минимуму инактивации инфекционных …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается первоначальное финансирование от Цинциннати детей исследовательский фонд (УК РФ) м.н. и инновационные Core Грант (ГСИ) поддерживается Национальным центром для продвижения трансляционная наук национальных институтов здравоохранения под Номер УЛ1 TR001425 премии. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
