Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture
Summary
Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.
Abstract
Histocultures laten studeren intercellulaire interacties binnen de menselijke weefsels, en ze kunnen worden ingezet om model gastheer-pathogeen interacties onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Ex vivo infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV), onder andere virussen, is met succes gebruikt om het onderzoeken van de vroege pathogenese van de ziekte, alsook een platform voor het testen van de werkzaamheid en de toxiciteit van antivirale middelen. In het huidige protocol, wij leggen uit hoe te verwerken en te infecteren met HIV-1 weefsel explantaten van menselijke amandelen en cervicale mucosae, hen cultuur op de top van gelatine sponzen op de vloeibare-lucht-interface voor gedurende ongeveer twee weken. Deze instelling niet-gepolariseerd cultuur maximaliseert toegang tot voedingsstoffen in cultuurmedium en zuurstof, hoewel progressief verlies van weefsel integriteit en functionele platforms haar belangrijkste beperking blijft. Deze methode zorgt voor de opvolging van HIV-1 replicatie en pathogenese met behulp van diverse technieken, waaronder immunoassay, qPCR en stroom cytometry. Van belang is, kan de fysiologische variabiliteit tussen weefsel donoren, alsmede tussen explantaten uit verschillende gebieden van het hetzelfde model, grote invloed op experimentele resultaten. Om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid van het resultaat, is het van cruciaal belang met een voldoende aantal explantaten, technische wordt gerepliceerd en donor-matched controlevoorwaarden te normaliseren van de resultaten van de experimentele behandelingen bij het opstellen van de gegevens uit meerdere experimenten (dwz ., uitgevoerd met behulp van weefsels van verschillende donoren) voor statistische analyse.
Introduction
Monotypisch bi-dimensionale celculturen, aangeduid als conventionele, geen rekening met de ruimtelijke en functionele communicatie tussen de grote verscheidenheid aan celtypes waaruit weefsels en organen. Dit aspect is van het allergrootste belang voor experimentele modellen van ziekte, zoals interferentie met homeostatische intercellulaire interacties de drijvende factor van alle pathologieën is. Weefsel explantaten bieden grote voordelen voor de modellering van gezondheid en ziekte bij de mens, omdat zij behouden de cytoarchitecture en veel belangrijke functionele aspecten van organen zoals ze zijn in vivo, hoewel het voor een beperkte hoeveelheid tijd1. Bijvoorbeeld bij ex vivo challenge met terugroepen antigenen, zoals difterie tetanustoxoïd of tetanus tetanustoxoïd, reageert tonsillar weefsel met een krachtige productie van antigeen-specifieke antilichamen2. Net als ieder ander ex vivo model, histoculture heeft zijn eigen beperkingen: Inter donor variabiliteit, weefsel polarisatie, beperkte weefsel overleven en moeilijkheden bij de controle op cellen buiten de diepte van de confocal microscopie1. Niettemin blijven de menselijk weefsel explantaten een model van keuze om homeostatische en pathogene immunologische processen bij de mens, met inbegrip van gastheer-pathogeen interacties en potentiële therapeutische interventies3te bestuderen.
De kritieke gebeurtenissen van de pathogenese van HIV-1 plaatsvinden in weefsels. Infecties van de genitale mucosa rekeningen voor de meerderheid van alle HIV-1 transmissie evenementen wereldwijd4. Lymfoïde weefsel is de belangrijkste site voor replicatie van het virus tijdens de acute infectie en herbergt een grote pool van latent geïnfecteerde cellen5, en hun persistentie vertegenwoordigt de voornaamste hinderpaal voor het bereiken van een genezing6. De cultuur en ex vivo uitdaging van menselijke lymfe en mucosal weefsels bieden een aantal voordelen ten opzichte van conventionele systemen op basis van geïsoleerde cellen voor de studie van HIV-1. Weefsel-ingezeten cellen kunnen bijvoorbeeld, HIV-1 infectie ondersteunen bij gebrek aan exogene activering, in tegenstelling tot perifere bloed mononucleaire cellen1. Het gebruik van lymfoïde weefsel explantaten heeft toegestaan een beter begrip van sommige belangrijke mechanismen die ten grondslag liggen aan CD4 T-cel uitputtingdat wil zeggen, de omstander effect7, dat is het kenmerk van een acute infectie. Het behoud van structuren zoals B cel follikels in de lymfoïde weefsel8 en het epithelium in vrouwelijke genitale mucosa explantaten9 biedt de unieke mogelijkheid om ruimtelijke en functionele eigenschappen van HIV-1 infectie op deze sites te integreren. Tot slot werden histocultures met succes gebruikt voor model en studie van HIV-1 en herpesvirus co-infectie10,11, alsmede voor preklinische testen van antiretrovirale en multitarget microbiciden12, 13 , 14 , 15.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de cultuur van menselijk weefsel explantaten verkregen van amandelen en mucosale weefsel van de lagere vrouwelijke genitale landstreek (baarmoederhals), die betrekking hebben op weefsel dissectie om explant challenge met HIV-1 in een niet-gepolariseerde manier. De cultuur van weefsel explantaten op de vloeibare-lucht-interface, met behulp van gelatine sponzen als ondersteuning, maximaliseert blootstelling aan zuurstof lucht terwijl het verstrekken van toegang tot kweekmedium voedingsstoffen via de spons haarvaten, dus vertragen hun natuurlijke verval. De meest directe manier van het evalueren van HIV-1 replicatie in ons systeem is voor het meten van de hoeveelheid virus in het kweekmedium explant vrijgegeven na verloop van tijd door immunoassay of qPCR. HIV-1 infectie en pathogenese (bv., CD4 T-cel depletie) kan ook worden geëvalueerd in weefsel explantaten door bulk RNA/DNA-extractie en qPCR, in situ kleuring, of één cel-analyse op weefsel vertering door stroom cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van menselijk weefsel explants voor de studie van HIV-1 infectie voordelen ten opzichte van de traditionele bi-dimensionale en monotypisch experimentele systemen, zoals primaire cellen of cellijnen, vanwege hun superieure vermogen biedt te reproduceren intercellulaire interacties en cellulaire functies (b.v.cytokine productie) zoals ze in vivo zijn. Niettemin, tonsillar en cervicale weefsel verschillen in vele aspecten, met inbegrip van het aantal, en de fenotypische en functionele kenmerken…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), de Stichting Zweedse artsen tegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) en Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) naar Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency. Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).
- Dezzutti, C. S. Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success. J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).
- Lederman, M. M., Margolis, L. The lymph node in HIV pathogenesis. Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).
- Biancotto, A., et al. HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo. Blood. 111 (2), 699-704 (2008).
- Van Laar, J. M., et al. Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells. Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).
- Introini, A., et al. Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants. PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).
- Grivel, J. C., et al. Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6. Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).
- Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides. Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).
- Lisco, A., et al. Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues. Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).
- Vanpouille, C., et al. A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo. AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).
- Andrei, G., et al. Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication. Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).
- Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides. J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).
- Saba, E., et al. HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model. Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).
- Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo. PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).
- Biancotto, A., et al. A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24. J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).
- Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses. Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).
- Keele, B. F., et al. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).
- Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone. Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).
- Ganor, Y., et al. Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates. Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).
- Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5. EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture. Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection. J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Saba, E., et al. Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle. Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).
