Ex Vivo Infection de la muqueuse génitale humain tissu lymphoïde et femelle avec le Virus de l’immunodéficience humaine 1 et Histoculture
Summary
Infection des tissus humains avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ex vivo fournit un précieux modèle 3D de la pathogenèse du virus. Nous décrivons ici un protocole pour traiter et infecter des échantillons de tissus d’amygdales humaines et des muqueuses génitales femelles avec le VIH-1 et les maintenir en culture à l’interface air-liquide.
Abstract
Histocultures permet d’étudier les interactions intercellulaires dans les tissus humains, et ils peuvent être employés à des interactions hôte-pathogène modèle dans des conditions contrôlées en laboratoire. Ex vivo l’infection des tissus humains avec le virus d’immunodéficience (HIV), parmi d’autres virus, a été utilisée avec succès pour enquêter sur la pathogenèse précoce de la maladie, mais aussi une plateforme pour tester l’efficacité et la toxicité des médicaments antiviraux. Dans le présent protocole, nous expliquons comment traiter et infecter avec le VIH-1 des explants de tissus d’amygdales humaines et de la muqueuse du col utérin et leur maintien en culture sur le dessus de gélatine éponges à l’interface liquide-air pendant environ deux semaines. Ce paramètre de culture non polarisé maximise l’accès aux nutriments dans le milieu de culture et de l’oxygène, même si une perte progressive de l’intégrité des tissus et des architectures fonctionnelles reste sa principale limitation. Cette méthode permet de surveiller la réplication du VIH-1 et pathogenèse en utilisant plusieurs techniques, y compris les immunoessais, qPCR et cytométrie en flux. D’importance, la variabilité physiologique entre donneurs de tissus, ainsi qu’entre les explants provenant de régions différentes du même spécimen, peut affecter significativement les résultats expérimentaux. Afin d’assurer la reproductibilité du résultat, il est essentiel d’utiliser un nombre suffisant d’explants, répétitions techniques et des conditions de témoins du même donneur pour normaliser les résultats des traitements expérimentaux lors de la compilation des données provenant de multiples expériences (par exemple ., menée à l’aide de tissus de donneurs différents) pour l’analyse statistique.
Introduction
Les cultures de cellules bidimensionnels monotypique, référencés ici sous le nom conventionnel, n’expliquent pas la communication spatiale et fonctionnelle entre la grande variété de types de cellules qui composent les tissus et organes. Cet aspect revêt une importance primordiale pour les modèles expérimentaux de la maladie, comme interférence avec interactions intercellulaires homéostatiques est le facteur déterminant de toutes les pathologies. Des explants de tissus offrent des avantages majeurs pour la modélisation de la santé et la maladie chez les humains parce qu’ils conservent la cytoarchitecture et nombreux aspects fonctionnels des organes sont-ils en vivo, bien qu’une quantité limitée de temps1. Par exemple, après ex vivo provocation par des antigènes de rappel, tel que l’anatoxine diphtérique ou tétanique, tissu amygdalien répond avec une production vigoureuse des anticorps antigène-spécifiques2. Comme tout autre ex vivo modèle, histoculture a ses propres limites : variabilité inter-bailleurs de fonds, polarisation de tissu, la survie limitée des tissus et Difficulté dans le suivi des cellules au-delà de la profondeur de la microscopie confocale1. Des explants de tissus humains demeurent néanmoins, un modèle de choix pour étudier les processus immunologiques homéostatiques et pathogènes chez l’homme, y compris les interactions hôte-pathogène et les éventuelles interventions thérapeutiques3.
Les événements critiques de la pathogénèse du VIH-1 ont lieu dans les tissus. Infection de la muqueuse génitale représente la majorité de tous les VIH-1 transmission des événements dans le monde4. Tissu lymphoïde est le siège principal de la réplication du virus au cours de l’infection aiguë et héberge un bassin important de cellules infectées de façon latente5et leur persistance représente le principal obstacle pour parvenir à une guérison6. Le défi de la culture et ex vivo des tissus lymphoïdes et muqueuses humains offrent certains avantages par rapport aux systèmes conventionnels basés sur des cellules isolées pour l’étude du VIH-1. Par exemple, les cellules de tissu-résident peuvent prendre en charge HIV-1 infection en l’absence d’activation exogène, par opposition aux cellules mononucléaires de sang périphérique1. L’utilisation d’explants de tissu lymphoïde a permis une meilleure compréhension de certains mécanismes clés qui sous-tendent les lymphocytes T CD4 cell épuisementc’est-à-dire, le spectateur effet7, qui est la marque d’une infection aiguë. La préservation des structures telles que les follicules de lymphocytes B dans le tissu lymphoïde8 et de l’épithélium de la muqueuse génitale féminine des explants9 offre l’opportunité unique d’intégrer les caractéristiques spatiales et fonctionnelles de l’infection à VIH-1 sur ces sites. Enfin, les histocultures ont été utilisés avec succès au modèle et d’étude de10,la co-infection VIH-1 et herpèsvirus11, ainsi que pour les essais précliniques d’antirétroviraux et multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture des explants de tissus humains provenant des amygdales et les muqueuses de l’appareil génital féminin inférieur (col de l’utérus), couvrant la dissection des tissus pour explantation défi avec le VIH-1 de manière non polarisé. La culture d’explants de tissu à l’interface air-liquide, à l’aide d’éponges de gélatine comme support, optimise l’exposition à l’oxygène de l’air tout en fournissant un accès aux nutriments de milieu de culture par le biais de l’éponge capillaires, retardant ainsi leur désintégration naturelle. D’évaluer la réplication du VIH-1 dans notre système, la plus immédiate consiste à mesurer la quantité de virus libérés dans le milieu de culture des explants au fil du temps par dosage immunologique ou qPCR. Infection à VIH-1 et pathogénie (e.g., déplétion des cellules T CD4) aussi peut être évaluée dans des explants de tissus en vrac extraction ARN/ADN et qPCR, in situ de coloration ou seule cellule-analyse après digestion de tissus par cytométrie en flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de tissus humains des explants pour l’étude de l’infection VIH-1 fournit des avantages par rapport aux traditionnels systèmes expérimentaux bidimensionnels et monotypiques, telles que les cellules primaires ou des lignées de cellules, due à leur capacité supérieure de reproduire les interactions intercellulaires et cellulaire fonctionne (par exemple, la production de cytokines) qu’ils sont en vivo. Néanmoins, tissu amygdalien et cervical diffèrent sur de nombreux aspects, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), les médecins suédois de la Fondation contre le sida (http://www.aidsfond.se/, Réf. FOa2014-0006) et Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) d’Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
References
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