Summary

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

Published: April 09, 2018
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Summary

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。

Abstract

損傷やけがや組織の損傷部位に炎症時の白血球の募集は最近数十年間に調べたし、白血球接着連鎖の概念をもたらしました。ただし、白血球動員に関与する正確な分子メカニズムがまだ特定されていない完全に。接着のメカニズムを研究、解き放つ接着簡単流アッセイを提案する白血球動員に感染、炎症、および (自動-) 免疫研究の分野で重要な課題が残っているので、静脈と動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。生体外の試金を使用して、白血球と血管の炎症のさまざまなモデルの携帯パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを研究できます。このプロトコルは白血球と血管内皮細胞や血小板、可視化と、記録することができますとの相互作用を研究する並列フロー チャンバーとカメラに接続されている倒立位相差顕微鏡を使用して層流ベースの試金を記述します。オフライン分析。白血球や血小板、血管内皮細胞は、阻害剤またはこのプロセス中に特定の分子の役割を決定する抗体で前処理することができます。せん断条件、すなわち動脈または静脈剪断応力は粘性や灌流の流体の流量とチャネルの高さ簡単に合わせることができます。

Introduction

けが、炎症や感染症、時に白血球迅速に対応に病原体または損傷-関連分子パターン (PAMPs、DAMPs) アクティブ化された状態に変更し、血流から炎症と組織損傷のサイトに移動します。白血球の細胞・分子環境と対話できる能力は白血球接着欠乏1のような遺伝性疾患によって強調されるよう、免疫細胞としての正しい機能に不可欠です。白血球接着過去数十年の間に強烈な調査の対象とされている、初期の 1990 年代2,3における白血球接着カスケードのコンセプトになりました。白血球接着は、血管内皮細胞、血管の表面を転がしてにセルの原因への白血球のセレクチンを介したキャプチャによって開始されます。この圧延により内皮バインド渡り鳥手がかり、例えばケモカイン、インテグリンの活性化を誘導するためにスキャンする白血球です。その後、インテグリンの活性化は、しっかりした白血球逮捕で内皮配位子へのバインドを仲介します。白血球がクロールして広がり、内皮細胞の膜を貫通し、基になる組織に細胞の前に extravasate その後準備をします。正規白血球カスケードの基本概念は導入以来ほとんど変わらず、いくつかの中間の手順4を追加しました。それにもかかわらず、正確な分子メカニズムと白血球動員に関与する多くの選手の役割を持って、これまで解明されていない、白血球動員まま感染症、炎症、(自動) 免疫の分野で重要な課題研究。

たとえば、動脈硬化などの血管の炎症性疾患、血管壁ドライブ プラーク開発に白血球動員増加しました。不安定な動脈硬化性プラークが破裂する、血小板および凝固系の大規模な活性化とその後5容器の閉塞をリードします。心筋梗塞や脳卒中などの重篤な心血管リスクがあります。さらに、白血球と血小板 (例えば、マトリックス成分と滑らかな露出血管壁内部の相互作用の多数をもたらすそれは内皮細胞の侵食が臨床的に発生する例えば冠動脈ステント留置後心筋細胞) と血管傷害をカバーする血小板と白血球の。これらの相互作用が病気の新生内膜形成67のドライブ可能性があります単球血小板の相互作用としてのさらなる発展のために重要です。さらに、Mac 1 (αMβ2) 白血球インテグリンを介した血小板白血球の相互作用、血小板 GPIbα 最近マウス8で血栓症の新規ドライバーとして識別されています。

分離マトリックス分子の広いスペクトルと白血球と血管由来の不死化細胞株の研究との白血球と血小板の源として人間や動物の血液の普及を考えると、それは白血球のシミュレーションが可能設定、特別に設計された流灌流チャンバーを使用して実験室の流れの下での相互作用。多くの亜種は、自己粘着性灌流チャンバー真空駆動からまで、過去十年にわたって設計されています。すべての亜種は、不動の部分 (例えば、培養血管細胞または基質タンパク質) が動かない部分に液の灌流を有効にする事前に定義されたチャネルを装備した大きい防漏チャンバーに組み立てられる公有地であります。さらに、成形技術の進歩には、シリカ ポリマー9に基づくカスタム ソリューションの開発が有効になります。粘度と灌流の流体の流量とチャネルの高さ主流灌流装置10のせん断応力特性が決まります。この記事で提案する体外付着のメカニズムを研究、解き放つ接着法と静脈および動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。紹介した方法の利点は彼らが一般的なカメラに接続された蛍光顕微鏡を使用して実行できます、高い技術的な能力を所有する実験者を必要としません。In vitroアッセイ (例えば、阻害剤を追加または遮断抗体によって)、多くの方法で操作することができますつまり、血管の炎症のさまざまなモデルの適用とタンパク質機能接着の調査を可能または特定の化合物の評価。

Protocol

ここで説明したすべてのメソッドは、医療倫理とマーストリヒト大学動物倫理的な板によって承認されています。 1 ヒトの細胞とフロー ベースのアッセイ ヒトの血液から血小板を分離 クエン酸 (3.2%) 抗凝固薬の静脈血を描画します。 1/15 酸クエン酸ブドウ糖量を追加 (ACD: クエン酸ナトリウム 80 mM、52 mM クエン酸、183 mM グルコース) ?…

Representative Results

内皮白血球接着を研究に蛍光に分類された thp-1 細胞灌流 tnf α または非-刺激血管内皮膜 3 ダイン/cm2で 2 分間以上。付着性単球細胞の合計数は、2-6 分の期間にわたって六つの独立したフィールドをキャプチャすることにより血流の 2 分後定められました。付着性のセル (例えば、EVOS フロリダ) 倒立位相差/蛍光顕微鏡で撮影した少なくとも 6 で定量化さ?…

Discussion

この生体外の試金は血管の炎症の中に白血球動員の基になるメカニズムを調査する簡単な方法が、注意すべきいくつかの重要なポイントがあります。このアッセイを正常に実行するための最初の要件は、白血球と合流、そのまま血管や血小板膜の血流です。これは、コラーゲン タイプ表面の事前コーティング私によって達成できます。一般に、第一次血管細胞を操作するときは優しく…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ドクター マーティン ・ m ・ シュミットとラインの Fraemohs に感謝しますこの作品は、研 (ZonMW ビディ 016.126.358 輸血研究 (LSBR Nr。 1638) ランドスタイナー財団、ドイツ研究振興協会 (SFB1123/A2) R.R.K. に授与オランダ財団によって支えられました。

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

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Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

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