Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri
Summary
Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.
Abstract
Lökosit yaralanma veya iltihap sitelerine yaralanma veya doku hasarı üzerine alımı son yıllarda incelenmiş ve lökosit yapışma cascade kavramında sonuçlandı. Ancak, lökosit işe dahil tam moleküler mekanizmalar henüz tam olarak tespit edilmiştir değil. Lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık araştırma alanında önemli bir konu kalır bu yana, biz temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için basit bir laminar akış tabanlı tahlil mevcut ve hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin. Vitro tahlil lökosit ve damar iltihabı farklı modellerde hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı, lökosit ve endotel hücreleri veya görüntülenir ve sonra kaydedilen trombosit etkileşimleri çalışmaya paralel akış odası ve bir ters faz kontrast mikroskobu bir kameraya bağlı kullanarak bir laminar akış tabanlı tahlil açıklar çevrimdışı analiz. Endotel hücreleri, trombosit veya lökosit inhibitörleri veya bu işlem sırasında belirli molekülleri rolünü belirlemek için antikorlar ile pretreated. Kesme koşulları, Yani atardamar veya toplardamar kesme stres, kolayca viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği tarafından adapte edilebilir.
Introduction
Yaralanma, iltihap veya enfeksiyon lökosit hızlı patojen veya hasar-ilişkili için moleküler desen (PAMPs, DAMPs), aktif bir duruma değiştirmek ve inflamasyon ve doku hasarı sitelere kan akışı dışarı hareket yanıt. Onların hücresel ve moleküler çevre ile etkileşim olanağı lökositlerin lökosit yapışma eksikliği1gibi genetik bozukluklar tarafından vurgulanmış olarak bağışıklık hücreleri olarak onların doğru işlevi için esastır. Lökosit yapışma son on yıl boyunca yoğun soruşturma konusu olmuştur ve bu erken 1990’larda2,3lökosit yapışma cascade kavramı sonuçlandı. Lökosit yapışma lökositlerin endotel vasküler yüzey üzerinde rulo için hücreleri neden selektin-aracılı yakalama tarafından başlatılır. Bu inişli çıkışlı lökositlerin endotel bağımlı göçmen cues, örneğin, integrinler aktivasyonu teşvik kemokinler için taramak sağlar. Daha sonra aktif integrinler firma lökosit durması sonucu bağlama endotel ligandlar için aracılık. Lökosit daha sonra tarama ve endotel monolayer delici ve temel dokusuna transmigrating önce yayarak extravasate hazırlayabilirsiniz. Kurallı lökosit cascade temel kavramı sunulmasından bu yana büyük ölçüde değişmeden kalmıştır, bazı ara adımlar ile4ekledi. Yine de, tam moleküler mekanizmaları ve lökosit işe dahil birçok oyuncu rollerini şu ana kadar açıklık olmuştur değil ve lökosit işe alım enfeksiyon, inflamasyon ve (auto-) bağışıklık alanında önemli bir konu kalır araştırma.
Örneğin, ateroskleroz gibi vasküler inflamatuar hastalıklar sırasında gemi duvar sürücüler plak gelişme içine lökosit işe arttı. Kararsız aterosklerotik plaklar rüptürü, trombosit ve koagülasyon sisteminin büyük harekete geçirmek ve daha sonra5damar tıkanıklığı. Bu kalp krizi veya felç gibi ciddi kardiyovasküler sonuçlara yol açabilir. Buna ek olarak, klinik olarak, olarak endotel denudation oluşur örneğin bir koroner arter uygulaması sonra yol açar lökosit ve trombosit maruz damar duvar iç (örneğin, matris bileşenleri ve pürüzsüz etkileşimler çok sayıda kas hücreleri) ve vasküler yaralanma kapsayan trombosit ile lökositlerin. Bu etkileşimler monosit-trombosit etkileşimleri neointima oluşumu6,7sürücü olarak daha da geliştirilmesi hastalık için önemlidir. Buna ek olarak, trombosit-lökosit etkileşimleri lökosit integrin Mac-1 (αMβ2) aracılı ve trombosit GPIbα trombozu fareler8roman sürücüleri olarak son zamanlarda belirlenmiştir.
İnsan ve hayvan kan geniş durumu lökosit ve trombosit bir kaynak olarak araştırma ve izole matris molekülleri geniş yelpazede ve lökosit ve vasküler kökenli ölümsüzleştirdi hücre hatları için göz önüne alındığında, lökosit benzetimini yapmak için uygun etkileşimler bir laboratuvar ayarı, özel olarak tasarlanmış akışı perfüzyon Chambers’ı kullanarak akış altında. Adl değişik vakum odaklı kendinden yapışkanlı perfüzyon odalarına kadar geçen on yıl boyunca tasarlanmıştır. Tüm türevleri ortak yönü hareketsiz bölümü (örneğin, kültürlü damar hücreleri veya matris proteinler) önceden tanımlanmış bir kanal perfüzyon sıvıların hareketsiz bölümü üzerinde etkinleştirme ile donatılmış büyük bir sızıntı geçirmez odasına monte var. Buna ek olarak, teknoloji kalıp gelişmeler silis polimerler9tarihinde alan ısmarlama çözümler geliştirme etkin. Viskozite ve perfused sıvı akış hızı ve kanal yüksekliği esas olarak akış perfüzyon aygıt10makaslama stres özelliklerini belirlemek. Bu makalede, biz bir temel mekanizmaları yapıştırılması çalışma, de-yapışma için vitro yöntemi ve Hicret Arteryel ve venöz akışı rejimler altında lökositlerin mevcut. Burada sunulan yöntemleri onlar ortak kamera bağlı floresan mikroskop kullanılarak yapılır ve yüksek teknik yeterlilik Uluslararas› bir Denemecileri gerektirmeyen avantajdır. Vitro tahlil (inhibitörleri ekleyerek veya antikor engellemeörneğin,), birçok yönden manipüle edilebilir ve böylece damar iltihabı farklı modellerinde geçerli ve yapışma incelenmesi protein işlevleri sağlar veya belirli bileşikler değerlendirilmesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu vitro tahlil vasküler enflamasyon sırasında lökosit alımı temel mekanizmaları araştırmak için basit bir yöntemdir, ancak dikkat edilmesi gereken bazı kritik nokta. Bu tahlil başarıyla gerçekleştirmek için ilk perfüzyon lökosit bir sağlam ve Konfluent vasküler veya trombosit monolayer gereksinimdir. Bu önceden kaplama kollajen türü olan yüzeylerin tarafından ben elde edilebilir. Genel olarak, birincil damar hücreleri ile çalışırken, yavaşça önerilen collagenase içeren dekolma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Drs. Martin M. Schmitt ve satır Fraemohs teşekkür ederim. Bu eser bilimsel araştırma (ZonMW VIDI 016.126.358, Landsteiner Vakfı kan nakli araştırma (LSBR Nr. 1638) ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) R.R.K. için ödül için Hollanda Vakfı tarafından desteklenmiştir
Materials
| Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL | Life Technologies Europe bv | ||
| Pump e.g. model: 210-CE | world precision instruments | 78-9210W | |
| Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | corning | 353001 | |
| 50 mL syringe | Becton Dickinson | 300137 | |
| Silicone tubing | VWR | 228-0700 | |
| Elbow Luer Connector Male | Ibidi | 10802 | |
| Female Luer Lock Coupler | Ibidi | 10823 | |
| Flow chamber | University Hospital RWTH Aachen | Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. | |
| Ibidi sticky slide VI 0.4 | Ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Collagen Type I, rat tail | Life Technologies Europe bv | A1048301 | |
| Recombinant Human TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) | Anaspec / Eurogentec | 24191 | |
| SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain | Life Technologies Europe bv | S7575 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution 10x | Sigma-Aldrich Chemie | H4641 | |
| HEPES buffer solution 1M, liquid | Life Technologies Europe bv | 15630049 | |
| BUMINATE Albumin, 25% | Baxter | 60010 | |
| Water for injection | B. Braun | 3624315 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich Chemie | M2670 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich Chemie | A6535 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Promocell GmbH | C-12203 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) | Promocell GmbH | C-22010 | |
| Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) | ATCC | PCS-100-011 | |
| Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
| Endothelial Cell Growth Kit-BBE | ATCC | PCS-100-040 | |
| Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) | ATCC | PCS-100-012 | |
| Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit | ATCC | PCS-100-042 | |
| Human endothelial cell line, EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) | ATCC | CRL-2181 | |
| Human Monocytic cell line, THP-1 | DSMZ | ACC-16 | |
| RPMI 1640 with Ultra-Glutamine | Lonza | BE12-702F/U1 | |
| Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 | ATCC | TIB-71 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose | Gibco | 11965092 | |
| Accutase | Promocell GmbH | C-41310 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich Chemie | P1644 | |
| Histopaque 1119 | Sigma-Aldrich Chemie | 11191 | |
| 10x PBS | Life Technologies Europe bv | 14200075 | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin | Becton Dickinson | 367876 | |
| VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2% | Greiner Bio | 455322 | |
| HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water | Sigma-Aldrich Chemie | Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood |
References
- Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
- Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
- Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
- Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
- Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
- Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
- Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).
