Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar
Summary
Yeni iletişim kuralları burada yalıtmak ve insan türetilmiş microparticles karakterize açıklanmıştır ve fare nötrofiller. Bu protokoller ultrasantrifüj, Akış Sitometresi ve microparticle içeriği analiz etmek için immunoblotting teknikleri kullanmak ve çeşitli hücre tiplerinin hücresel işlevde türetilen microparticles rolü çalışma için kullanılabilir.
Abstract
Polimorfonükleer nötrofil kaynaklı microparticles (PMN)-MPs) lipid bilayer, çapı 50-1000 nm arasında değişen boyutlarıyla küresel microvesicles vardır. MPs bir yeni gelişen, hücre hücre iletişim ve sinyal makine önemli parçası vardır. Büyüklükleri ve serbest bırakılmaları doğası nedeniyle, yakın zamana kadar MP varlığını gözden oldu. Ancak, gelişmiş teknoloji ve analitik yöntemleri ile sağlık ve hastalık kendi işlevleriyle şimdi ortaya çıkıyor. Burada sunulan protokolleri Akış Sitometresi ve immunoblotting tarafından izole edip PMN-MPs karakterize hedefleniyor. Ayrıca, çeşitli uygulama örnekleri verilmiştir. Bu protokoller MP yalıtım için hızlı, ucuz ve pahalı setleri kullanılması gerekli değildir. Ayrıca, onlar bir membran özel floresan boya kullanarak görselleştirme ve analiz için Akış Sitometresi tarafından yalıtım aşağıdaki gibi MP yayın önce kaynak hücrelerinin önceden etiketleme MPs etiketleme için izin. Bu yöntemi ancak, saflık PMNs ve MPs ve gelişmiş analitik araçları ihtiyacını da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Bir high-end Akış Sitometresi güvenilir MPs analiz ve yanlış pozitif okuma gürültü veya otomatik Floresans nedeniyle en aza indirmek için gereklidir. Açıklanan protokoller yalıtmak ve MP Biyogenez tanımlamak için kullanılan ve onların işaretleri ve kompozisyon farklı uyarıcı koşullar altında varyasyon karakterize. Boyutu heterojenite membran parçacıklar exosomes karşı içeriğini farklı olup olmadığı ve olup doku homeostazı içinde farklı rolleri yerine getirmek araştırmak için yararlanılabilir. Son olarak, aşağıdaki yalıtım ve karakterizasyonu MPs, hücresel yanıt işlevlerine ve çeşitli hastalık modelleri (dahil olmak üzere, inflamatuar barsak hastalıkları veya akut akciğer yaralanma gibi PMN ilişkili enflamatuar bozuklukları) düzenlemelidir.
Introduction
Çapı, 50-1000 nm arasında değişen bu yapıların biyolojik bilgi taşıdığını ortaya çıkan veri önerdiği gibi son zamanlarda, “microparticles/microvesicles” hücre sitozol ve plazma zarı’büyük bilimsel ilgi haline gelmiştir ve hücresel iletişim kurallı olmayan bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bağışıklık hücre MPs kaynaklı ve özellikle bu polimorfonükleer nötrofiller (PMNs) tarafından üretilen PMNs önemli rolü ana savunma1,2, inflamatuar yanıt3ve yara iyileşmesi verilen büyük ilgi vardır 4. çoğu intriguingly konularda, şimdiye kadar çok sayıda rapor pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar PMN-MPs5bir potansiyel içerik-, hastalık, türler- ve MPs organ özgü rolü düşündüren, işlevlerinin göstermiştir.
Bu iletişimde açıklanan protokoller MPs işlevi sağlığı ve hastalıkları eğitim için düşük maliyetli, yenilikçi ve uyarlanabilir bir yöntem sağlar. Onlar birçok model organizmalar, organları ve stimülasyon koşullara tabidir. Onlar çeşitli MPs tanımlanması için izin ve gelecekte pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar işlevlerini gidermek için kullanılan. Örneğin, açıklanan işte PMN-MPs işlevi epitel yara iyileşme vitro ve içinde vivoçalışma. Kemik iliği türevi PMNs yukarıda açıklanan yöntem6bazı değişikliklerle adapte fare yalıtım için sunulan protokolü.
Ayrıca, bu çalışmada açıklanan protokollere algılama ve PMN-MPs üzerinde iki tamamlayıcı yöntemler tarafından bulunabilir belirli işaretleri karakterizasyonu için izin ver: Western blot ve Akış Sitometresi. İmmunoblotting standart protokolleri5 kullanarak MPs, kolay ve güvenilir, ancak, şimdi daha fazla MPs analiz için izin duyarlılık Akış Sitometresi aletler ve geliştirilmiş gürültü sinyal oranı son gelişmeler bu yöntemi kullanarak bul. Bu çalışmada açıklanan protokoller son gelişmeler ve Santrifüjü hız ve zaman, örnek filtreleme ve donma/saklama koşulları7 ek değişiklikler de dahil olmak üzere özgün araştırma makaleleri gelen önerileri dahil , 8ve nasıl “arka plan gürültü” azaltmak, PMN-MPs algılama sınırını artırmak ve MPs farklı boyutlar arasında ayırımcılık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yalıtım ve MPs PMN kaynaklı karakterizasyonu için protokoller bu iletişimde açıklanmıştır. Birkaç anahtar kritik noktaları yordamı başarısı için dikkate alınması gerekir. İlk olarak, PMNs taze izole ve deneyler 2s tecrit içinde kendiliğinden harekete geçirmek ve degranulation önlemek için kullanılan gerekir. Tüm işleme PMNs sırasında yalıtım ve stimülasyon noktasına kadar harekete geçirmek ve erken MP yayın12önlemek için buza gerçekleştirilmelidir. İkinci o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kuzeybatı Feinberg okul, tıp Akış Sitometresi çekirdek işleten Dr. Suchitra Swaminathan teknik yardım için sana şükrediyoruz. Finansman (NIH) DK101675 tarafından sağlandı.
Materials
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
- Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
- Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
- Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
- Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
- Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
- Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
- Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).
