Un protocolo para la producción de vectores lentivirales integrasa deficientes para CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout en dividir las células

Edición precisa gen constituye la piedra angular de los avances biomédicos importantes que implican el desarrollo de nuevas estrategias para hacer frente a enfermedades genéticas. En la vanguardia de las tecnologías de edición de gene es el método apoyándose en el uso de la clustered regularly –nterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que inicialmente fue identificado como un componente de inmunidad bacteriana contra la invasión de material genético viral (revisado en las referencias^1,2). Una ventaja importante del sistema CRISPR/Cas9 sobre otras herramientas de edición de gen, como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y nucleasas de efectores como activador de transcripción (TALENs) (revisadas en la referencia³), es la relativa simplicidad del diseño de plásmido y construcción de componentes CRISPR — una característica que ha impulsado la expansión de la edición de genes de unos laboratorios especializados a una comunidad de investigación mucho más amplia. Además, la sencillez de programación CRISPR/Cas9 y su capacidad de reconocimiento de destino multiplexado más han alimentado su popularidad como una tecnología rentable y fácil de usar. Entre los diversos métodos disponibles para los investigadores entregar dichos componentes de edición de gen a las células, vectores virales siguen siendo por lejos el sistema más popular y eficiente.

Vectores lentivirales (LVs) han surgido como el vehículo de elección para entregar los componentes de CRISPR/Cas9 sistema en vivo para diversas aplicaciones^4,5,6,7. Varias características claves hacen LVs una opción popular para este proceso, incluyendo su capacidad para infectar células divisorias y no dividir, inmunogenicidad baja y mínima toxicidad celular (revisado en la referencia⁸). Como resultado, la terapia génica mediada por LV se ha empleado en tratamientos de enfermedades infecciosas, como VIH-1 y HBV HSV-1, así como en la corrección de los defectos subyacentes humanas enfermedades hereditarias, como fibrosis quística y degeneración macular neo-vascular ^{4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11}. Además, LVs han sido efectivamente modificados para realizar edición de multiplex gen en distintos lugares geométricos genomic usando un vector único sistema¹².

Sin embargo, la propiedad inherente de LVs para integrar en el genoma del anfitrión puede ser mutagénica y desventajas a menudo su utilidad como transgen vehículos de entrega, especialmente en contextos clínicos. Por otra parte, puesto que LVs estable integrado expresan sus transgenes sosteniblemente altos niveles, este sistema es inadecuados para la entrega de los componentes gene-edición como CRISPR/Cas9; sobreexpresión de Cas9-guía RNA (gRNA) y proteínas similares como ZFNs, están asociados con niveles elevados de efectos off-target, que incluyen mutaciones indeseables^{13,14,15,16 , 17} y potencialmente puede aumentar la citotoxicidad¹⁸. Por lo tanto, para lograr precisa edición de genes con efectos mínimos de fuera de objetivo, es imperativo el diseño de sistemas que permiten la expresión transitoria del gen editar componentes.

En los últimos años, han desarrollado una variedad de plataformas para expresar transitoriamente CRISPR/Cas9 de las células^16,19,20,21 (revisado en la referencia²²). Estos incluyen métodos que dependen directamente introducir Cas9 purificada junto con las guía apropiada RNAs en las células, que mostró ser más eficaz en el objetivo gene-edición en comparación con la transfección mediada por plásmido¹⁶. Los estudios han demostrado eso ribonucleoproteína (RNP) guían de complejos de RNA/Cas9 partículas rápidamente turned over después de mediar el clivaje de ADN en sus objetivos, lo que sugiere que la expresión a corto plazo de estos componentes es suficiente para lograr gene robusto edición¹⁶. Concebible, no integrando plataformas de vector viral como vectores virales adeno-asociado (AAVs) pueden proporcionar una alternativa viable para ofrecer maquinaria edición de genes a las células. Desafortunadamente, cápsida AAV posee menor capacidad de envasado de LVs (< 5kb), que dificulta seriamente su capacidad para empaquetar el toolkit CRISPR varios componente dentro de un único vector (revisado en la referencia⁸). Cabe destacar que además de compuestos que inhiben la histona desacetilasas (p. ej., sodio butirato²³) o impedir el ciclo de la célula (por ejemplo, cafeína²⁴) han demostrado aumentar títulos lentivirales. A pesar del progreso reciente, los sistemas de expresión transitoria desarrollados hasta ahora son aún obstaculizados por varias deficiencias, como la baja eficiencia de la producción, que conducen a títulos virales reducción y eficiencia de transducción de la baja de los virus generados a través de tales enfoques²⁵.

Integrasa-deficientes vectores lentivirales (IDLVs) representan un gran avance en el desarrollo de vectores de genes, ya que la capacidad de envasado de LVs con la ventaja añadida de AAV-como mantenimiento episomal en las células. Estas características ayudan a IDLVs en gran medida evadir los problemas principales asociados con integración de vectores, sobreexpresión continua vis-á-vis de potencialmente genotóxicos elementos y mutagenicidad mediada por la integración. Se demostró previamente que IDLVs pueden ser modificadas con éxito para mejorar la expresión de gene episomal^26,27. Con respecto a la entrega mediada por IDLV CRISPR/Cas9, títulos de baja producción y menor expresión de los genomas episome transmitidas en relación con sistemas lentivirales integrasa dominio limita su utilidad como herramientas de bona fide para la entrega de la edición del genoma construcciones transgénicas. Recientemente hemos demostrado que la expresión del transgen y títulos virales asociados con la producción de IDLV son mejorados significativamente por la inclusión de sitios para el factor de transcripción Sp1 dentro de la expresión viral cassette²⁸de Unión. Las IDLVs modificadas sólidamente apoyado CRISPR-mediated gene edición en vitro (en células HEK-293T) tanto en vivo (en las neuronas del cerebro del poste-mitotic), mientras que la inducción de mutaciones de objetivo mínimo en comparación con la correspondiente ICLV-mediada sistemas²⁸. En general, hemos desarrollado una novela, toolkit CRISPR compacto, todo-en-uno había llevado en una plataforma IDLV y había descrito las ventajas de la utilización de un vehículo de entrega para la edición de genética mejorada.

Aquí, el protocolo de producción del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 se describe, incluyendo los distintos pasos involucrados en la Asamblea, purificación, concentración y valoración de IDLVs, así como estrategias para validar la eficacia de edición génica de estos vectores. Este protocolo es fácilmente escalable para satisfacer las necesidades de los diferentes investigadores y está diseñado para generar con éxito vectores del LV con los títulos en el rango de 1 x 10¹⁰ transducing unidades (TU) / mL. Los vectores generados a través de este protocolo pueden ser utilizados para infectar eficientemente varios diferentes tipos de células, incluso difícil de transducir las células madre embrionarias, las células hematopoyéticas (las células T y macrófagos) y cultivadas y en vivo– neuronas inyectadas. Además, el protocolo es igualmente adecuado para la producción de vectores lentivirales integrasa competente en cantidades similares.

Figura 1: embalaje de IDLV. (a) diagrama esquemático del tipo salvaje integrasa proteína (b) el plásmido modificado fue derivado de psPAX2 (vea métodos, construcción de plásmidos para más detalles). Imagen de gel agarosa representante de clones para clones mutados integrasa. Se analizaron muestras de ADN preparadas con el equipo Mini de aislamiento estándar plásmido ADN por digestión con EcoRV y SphI. El clon correctamente digeridos (número 5, caja roja discontinua) más se verificó por la secuencia directa (Sanger) para la sustitución de D64E en INT. El casete de la integrasa-deficiente embalaje fue nombrado pBK43. (c) esquema del Protocolo de la transfección transitoria empleada para generar vectores IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando las células 293T transfectadas con VSV-G, embalaje y cintas de transgenes (Sp1-CRISPR/Cas9 plásmido de all-in-one). Partículas virales que bud hacia fuera de la membrana de la célula contienen el RNA integral del vector (expresado del cassette de transgen). Se utilizó la segunda generación del sistema IDLV-embalaje, que incluye las proteínas reguladoras Tat y expresión de Reverendo Rev además se complementa de un cassette independiente (RSV-REV-plásmido). Abreviatura: virus de estomatitis vesicular de repetición, VSV-G, LTR-largo-terminal G proteína, promotor de citomegalovirus pCMV; Promotor de Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento de respuesta Rev). Otros elementos regulatorios en los cassettes de expresión incluyen sitios de unión de Sp1, elemento de la Rev Response (RRE), marmota Hepatitis Virus postranscripcional regulador elemento (WPRE), núcleo-alargamiento factor 1α promotora (EFS-NC), el paquete del vector elemento ψ (psi), promotor de citomegalovirus (hCMV) humano y humano promotor U6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.