Мы описываем Производственная стратегия интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) как транспортные средства для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 клеток. С возможностью выступить посредником, быстрый и надежный гена редактирования в ячейках IDLVs представляют более безопасным и столь же эффективным вектор платформы для доставки генов по сравнению с интеграза компетентных векторов.
Лентивирусные векторы являются идеальным выбором для доставки генов редактирования компонентов клетки из-за их способности для стабильно преобразователя широкий диапазон ячеек и посредническая высокий уровень экспрессии генов. Однако их способность интегрироваться в геном клетки принимающей повышает риск инсерционному мутагенность и таким образом поднимает проблемы безопасности и ограничивает их использование в клинических условиях. Кроме того постоянное выражение гена редактирования компонентов выступил эти интеграции компетентным лентивирусные векторы (ICLVs) увеличивает вероятность прослушивающем гена ориентации. В качестве альтернативы новое поколение интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) был разработан, рассматриваются многие из этих проблем. Здесь протокол производства новых и усовершенствованных IDLV платформы для редактирования ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена и список шаги занимающихся очищения и концентрации таких векторов описан и их электромеханической эффективности ген редактирования с помощью ГЭС 293T был продемонстрирован клетки. Этот протокол легко масштабируема и может использоваться для создания высокого титра IDLVs, которые способны преобразователя клетки в пробирке и в естественных условиях. Кроме того этот протокол может быть легко приспособлено для производства ICLVs.
Точное гена редактирования является краеугольным камнем основные биомедицинских достижений, которые предполагают разработку новых стратегий для решения генетических заболеваний. На переднем крае технологий ген редактирования является метод, опираясь на использование cЕврошифер regularly –яnterspaced short palindromic repeats (ТРИФОСФАТЫ) / Cas9 система, которая была первоначально определена как компонент бактериальной иммунитет против вторжения вирусного генетического материала (Обзор ссылки1,2). Основным преимуществом системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 над другими инструменты для редактирования гена, таких как Цинк пальцевый nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) (обзор в ссылку3), является относительная простота плазмида дизайн и Строительство ТРИФОСФАТЫ компонентов — это функция, которая питание расширения гена редактирования из нескольких специализированных лабораторий для гораздо более широкого исследовательского сообщества. Кроме того Простота программирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и его потенциала для распознавания цели мультиплексном далее подпитывают его популярность в качестве экономически эффективной и простой в использовании технологии. Среди различных методов, доступных для исследователей, чтобы доставить такой ген редактирования компонентов клетки вирусных векторов на сегодняшний день остаются наиболее популярной и эффективной системы.
Лентивирусные векторы (ПЗ) появились как транспортное средство выбора для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы в естественных условиях для различных приложений4,5,6,7. Несколько ключевых функций делают LVs популярным выбором для этого процесса, включая их способность инфицировать деления и не деления клетки, низкой иммуногенностью и минимальным сотовой токсичности (обзор в ссылка8). В результате был нанят LV-опосредованной генная терапия в лечении инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-1, ГВ и ВПГ-1, а также в коррекции дефектов, лежащих в основе человеческого наследственных заболеваний, таких, как кистозный фиброз и нео сосудистая дегенерация желтого пятна 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Кроме того, LVs эффективно изменен для выполнения мультиплекс гена редактирования на собственный геномной локусов, используя один вектор системы12.
Однако присущие собственности LVs интегрировать в хост геномов может быть мутагенных и часто препятствует их полезность как средства доставки трансген, особенно в клинических условиях. Кроме того поскольку стабильно интегрированных LVs выразить их трансгенов на устойчиво высоком уровне, эта система плохо подходит для доставки генов редактирования компонентов, таких как ТРИФОСФАТЫ/Cas9; Сверхэкспрессия Cas9-руководство РНК (gRNA) и похожие белки, такие как ZFNs, связаны с повышенным уровнем пробить эффектов, которые включают в себя нежелательные мутации13,14,,1516 , 17 и потенциально может повысить цитотоксичность18. Таким образом для достижения точного редактирования гена с минимальными пробить эффекты, важно для разработки систем, которые позволяют для переходных экспрессии гена редактирования компонентов.
В последние годы был разработан целый ряд платформ доставки выразить временно ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в клетки16,–19,20,21 (обзор в ссылку22). К ним относятся методы, которые полагаются на непосредственно представляя очищенный Cas9 вместе с соответствующим руководством РНК в клетки, который был показан более эффективными на целевых генов редактирования по сравнению с плазмида опосредованной трансфекции16. Исследования показали, что рибонуклеопротеида (RNP) комплексов, состоящих из руководство РНК/Cas9 частиц быстро перевернулся после посреднических расщепления ДНК на их цели, предполагая, что краткосрочные выражение этих компонентов является достаточной для достижения надежные ген редактирования16. Предположительно,-интеграция вирусный вектор платформ, таких как аденоассоциированный вирусных векторов (AAVs) может обеспечить жизнеспособную альтернативу доставить ген редактирования техники в клетки. К сожалению, Аав capsids обладают значительно ниже возможности упаковки чем LVs (< 5kb), которая серьезно ограничивает их способность упаковки многокомпонентных ТРИФОСФАТЫ инструментарий в пределах одного вектора (обзор в ссылка8). Стоит отметить, что для увеличения лентивирусные титры было показано добавление соединений, которые подавляют гистона комплексы (например, натрия бутират23) или препятствуют клеточного цикла (например, кофеин24). Несмотря на недавний прогресс переходных выражение систем, разработанных до настоящего времени по-прежнему препятствует ряд недостатков, например ниже эффективности производства, которые ведут к снижение вирусной титры и низкой электромеханической эффективности вирусов, порожденных через такие подходы к25.
Интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) представляют собой основные улучшения в развитии средств доставки генов, как они сочетают в себе возможность упаковки LVs с дополнительным преимуществом AAV-как episomal содержание в клетках. Эти функции помогают IDLVs значительной степени обойти основные вопросы, связанные с интеграции векторы, vis-à-vis непрерывной гиперэкспрессия потенциально генотоксичных элементов и интеграции опосредованной мутагенность. Ранее было показано, что IDLVs может быть успешно изменен для повышения episomal ген выражение26,27. Что касается IDLV-опосредованной ТРИФОСФАТЫ/Cas9 доставки низкие производственные титры и Нижняя выражение episome нести геномов относительно интеграза владеют лентивирусные систем ограничивает их полезность как средства bona fide для доставки изменения генома Трансгенные конструкции. Мы недавно продемонстрировали, что трансген выражение и вирусных титры, связанные с производством IDLV значительно усиливается включение привязки сайтов для транскрипционного фактора Sp1 в течение вирусных выражение кассеты28. Изменение IDLVs энергично поддерживает ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена, редактирования в пробирке (в клетках ГЭС 293T) и в естественных условиях (в постсоветском митотическая мозга, нейроны), а заставить минимальный пробить мутации, по сравнению с соответствующим ICLV-опосредованной 28систем. В целом мы разработали роман, компактный, все-в-одном инструментарий ТРИФОСФАТЫ осуществляется на платформе IDLV и изложил различные преимущества использования такого доставки транспортного средства для расширения гена редактирования.
Здесь протокол производства системы IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 описано, включая различные этапы в Ассамблее, очистки, концентрации и титрование IDLVs, а также стратегии для проверки редактирования гена эффективность этих векторов. Этот протокол легко масштабируется для удовлетворения потребностей различных следователей и предназначен для успешного создания LV векторов с титры в диапазоне от 1 x 1010 преобразователя единиц (ту) / мл. Векторы, порожденных через этот протокол может использоваться эффективно заразить несколько различных типов клеток, включая сложные передают эмбриональных стволовых клеток, гемопоэтические клетки (Т-лимфоцитов и макрофагов) и культивировали и в vivo– вводят нейронов. Кроме того протокол одинаково хорошо подходит для производства интеграза компетентных лентивирусные векторы в аналогичных количествах.
Рисунок 1: Упаковка IDLV. () схема дикого типа интеграза белка (b) изменение плазмида была взята из psPAX2 (см. методы, плазмида строительство для подробной информации). Представитель агарозы гель изображение клонов, экранированный мутировавших интеграза клонов. Пищеварение с EcoRV и SphI были проанализированы образцы ДНК, подготовлен с использованием стандартных плазмида ДНК изоляции Мини-кит. Правильно переварить клон (число 5, пунктирной красной рамкой) был проверен последовательности прямых (Сэнгер) для замены D64E в INT. Кассета интеграза недостаточным упаковки был назван pBK43. (c) схема протокола переходных трансфекции работу для создания IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов, показываю что transfected клеток 293T с VSV-G, упаковки и трансген кассеты (Sp1-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 все-в-одном плазмида). Вирусные частицы, которые бутон из клеточной мембраны содержат полнометражного РНК вектора (выразил от трансген кассеты). Второе поколение IDLV-упаковочные системы была использована, которая включает в себя регуляторных белков ТАТ и преподобный Rev выражение дополнить с отдельной кассеты (RSV-REV-плазмиды). Abbrev: вирус повтор, VSV-G, везикулярного стоматита LTR-Лонг терминал G-белок, промоутер pCMV цитомегаловирус; Промоутер саркомы Рауса вирус (RSV); RRE-(Rev ответ элемент). Другие нормативные элементы на кассету выражения включают Sp1-привязки сайтов, Rev ответ элемента (RRE), сурок гепатитом вирус посттранскрипционного регулирования элемент (WPRE), удлинение основной фактор 1α промоутер (EFS-NC), упаковка вектор элемент ψ (psi), человека промоутер цитомегаловирус (hCMV) и человека U6 промоутер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
IDLVs начали появляться как средство выбора в vivo гена редактирования, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом ввиду низкого риска мутагенеза, связанные с эти векторы, по сравнению с интеграции платформ доставки22 , 28. в текущем ру…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Департамент нейробиологии, школа медицины при университете Дьюка и деканат по фундаментальной науки, Университет Дьюка. Мы также благодарим членов герцог вирусный вектор ядра для комментариев на рукопись. Плазмида pLenti CRISPRv2 был подарок от Чжан Фэн (широкой институт). LV-упаковочная система, включая psPAX2 плазмид, VSV-G, pMD2.G и pRSV-Rev был вид подарок от наконец Дидье (EPFL, Швейцария). Финансовая поддержка для проведения этой работы была оказана университета Южной Каролины школы медицины, Грант RDF18080-Е202 (B.K).
Equipment | |||
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
xMark Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
SW32Ti swinging-bucket rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
Tissue culture pipettes, 5 mL | Corning | 4487 | |
Tissue culture pipettes, 10 mL | Corning | 4488 | |
Tissue culture pipettes, 25 mL | Corning | 4489 | |
Hemacytometer with cover slips | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture reagents | |||
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
p24 ELISA reagents | |||
Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmids | |||
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Restriction enzymes | |||
BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
PacI | New England Biolabs | R0547S | |
SphI | New England Biolabs | R0182S |