JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

Published: January 08, 2018
doi:
10.3791/56912
, ,
1R&D Department,Cytoskeleton Inc.

Summary

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

Abstract

עכשיו זה היטב להערכה כי שינויים post-translational (PTMs) לשחק תפקיד חשוב בוויסות של חלבון מבנה, תפקוד, אשר עשוי להיות חיוני לתפקיד של חלבון נתון הן מבחינה פיזיולוגית והן מבחינה פתולוגית. העשרה של PTMs יש צורך לעיתים קרובות כאשר חוקרת את מצב PTM חלבון המטרה, משום PTMs הם בדרך כלל חולפים, נמוכה יחסית שפע. רבים החסרונות הם שאירעה בעת מועילות PTM של חלבון היעד, כגון מאגר התאמה הנוגדן חלבון המטרה אינה תואמת-IP, לאבדן קשר PTM ואחרים. דרגת קושי מוגדל כאשר חוקרים PTMs מרובים כמו acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין זרחון על חלבון המטרה הנתונה. לימוד שילוב של אלה PTMs ייתכן שיהיה צורך, כמו crosstalk בין PTMs היא שכיחה וקריטיות עבור רגולציה חלבון. לעתים קרובות, אלה PTMs נלמדים במאגרי פירוק שונים ועם יצירות מעכב ייחודי. כדי לפשט את התהליך, מערכת פירוק denaturing ייחודי שפותח את זה ביעילות מבודד ושומר PTMs ארבע אלה; ובכך, מאפשר חקירת crosstalk פוטנציאליות במערכת פירוק יחיד. מערכת סינון ייחודי תוכנן כדי להסיר מזהמות דנ א גנומי מן lysate, אשר הוא תוצר לוואי בעייתיות של denaturing מאגרי. מטריצות זיקה חזקה מיקוד כל אחד PTMs ארבע פותחו בתיאום עם מערכת מאגר כדי למקסם את העשרה וזיהוי המדינות אנדוגני של אלה PTMs 4. הכלים לזיהוי מקיף זה PTM מייעלת את התהליך של קבלת מידע חיוני אודות אם חלבון הוא שונה על-ידי אחת מהפעולות אלה PTMs.

Introduction

שינויים post-translational (PTMs) הן בעלות רגולציה שינויים ל חלבון, לפיה השינוי הוא שנוספו או הוסרו באופן ספציפי. PTMs לעיתים דינמי, ארעית השינויים לשנות משמעותית את המבנה של החלבון, אינטראקציות עם השותף חלבונים, לוקליזציה המרחבי, ואני בסופו של דבר המאפשר החלבון לבצע פונקציות שונות1,2 , 3 , 4. PTMs נפוצים כל כך הם להגדיל את מספר הטפסים חלבון ייחודי (או proteoforms) ממוצרים ג’ין כ-30,000 מעל למיליון proteoforms5,6. זיהוי PTMs והגדרת את השפעתם על חלבון המטרה היא קריטית לכיוון ההבנה של החלבון פונקציות פיזיולוגיים ופתולוגיים7,8,9,10, 11,12,13,14. לעבוד על חלבונים בחר כאילו טובולין, p53, קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) יש מבואר התפקידים הרגולציה של16,PTMs15,17. מחקרים אלה חשפו את העובדה כי ויסות של חלבונים אלו מתרחשת על ידי מספר PTMs, במקרים רבים לבצע שינויים אלה לעבוד ביחד כדי לקדם את תפקיד ספציפי. מחקרים חדשים הראו כי crosstalk PTM שיתופיות והן שליליות יכול להתרחש על מספר חלבונים שונים18,19,20,21,22, 23,24,25. עם זאת, הפרופילים PTM של הרוב של חלבונים בנויים מ מספר מחקרים בהם השתמשו מודלים שונים ותנאים ייחודיים. מערכת אופטימיזציה לחקור PTMs מרובים במערכת אחת יהיה מאוד מועיל לזכות בתובנה crosstalk PTM פוטנציאליים על חלבון המטרה.

אתגר אחד עם חוקרים PTMs במערכת יחיד הוא PTMs ספציפיים נחקרות באמצעות מאגרים נפרדים פירוק. לדוגמה, הניצול של כמו ריפה או NP-40 מאגרי משמשים בדרך כלל עבור חקירות זרחון או ubiquitination עשוי להיות לקוי לימוד של PTM יציב כמו אוביקוויטין דמוי קטן משנה (סומו) ylation26. בנוסף, מאגרים שאינן denaturing אינם הולמים עבור אינטראקציות חלבון בריא, והוא יכול להוביל שווא חיוביים PTM זיהוי27. חוקרים PTMs במאגר פירוק denaturing עשוי להיות המועדפת, כפי שזה עדיף באופן משמעותי לבודד את החלבונים של תאים סלולריים כל28, מביצועם רוב אינטראקציות חלבון, ימנע פרוטאזות שמשנות את הברית PTM, כגון deSUMOylases 26; עם זאת, denaturing מאגרי עשוי להתפשר על היושרה של אחווה מסוימות ריאגנטים כגון אוביקוויטין מחייב הכלים המבוססים על תחום27. פיתוח מערכת פירוק denaturing, כמו ללמוד מספר PTMs של חלבון בכל מערכת תואמת ריאגנט זיקה יהיה מאוד מועיל עבור PTM crosstalk חקירות.

למרות מאגרי denaturing מפתח יתרונות שאינם denaturing מאגרים עבור חוקרים PTMs, הם משמשים פחות שכיח בגלל החסרונות שלהם משמעותית, כגון אי-תאימות עם חלבון קונבנציונאלי מבחני, משמעותי גנומית זיהום חומצה deoxyribonucleic (DNA), הפרעה ריאגנטים immunoprecipitation (IP)29. מחסרונות אלה עלולה לגרום נזק פוטנציאלי וזמן הכנה מורחבת חלבונים היעד בעת הטיית ה-DNA גנומי. שתי השיטות הנפוצות להטיית DNA כוללים מזרק פירוק ו sonication29. שתי השיטות מחייבות אופטימיזציה מקיפה, לעתים קרובות חוסר הפארמצבטית מדויק. שיטות אלטרנטיביות כדי להסיר את ה-DNA גנומי כוללים התוספת של DNAses; עם זאת, זה עשוי לדרוש מיטוב נוספות ושינויים בהרכב מאגר. בסופו של דבר, שיטה פשוטה לשחזור להסרת זיהום דנ א גנומי יהיה מועיל כאשר עובדים עם denaturing פירוק מאגרי PTM החקירות.

המטרה של טכניקה זו היא לפתח מערכת לבודד ולחקור ubiquitination (Ub), זרחון טירוזין (pY), SUMOylation 2/3 (סומו 2/3) ו- PTMs acetylation (Ac) ב מערכת יחידה לחקור יותר PTM crosstalk על חלבון המטרה. זו מערכת איתור PTM היה מנוצל לחקור במהירות את הפרופיל PTM אנדוגני של מספר חלבונים היעד במערכת אחת. תובנה חדשה crosstalk פוטנציאליים היה מזוהה30,31. בסך הכל, בטכניקה המתוארת כאן שיפור שיטות קיימות כדי לחקור את PTMs ואת PTM crosstalk בשלוש דרכים שונות: 1) מאגר denaturing ייחודי פותחה שמבודד חלבונים מכל התאים הסלולר, אך שהם עדיין תואם PTM זיקה ריאגנטים, 2) מערכת סינון ייחודי פותחה במהירות מסיר זיהום דנ א גנומי שפגע בסימני lysates עם הפארמצבטית גבוהה ולא דורש שום ציוד מיוחד, ו- 3) החרוזים זיקה חזקה, פירוק מערכת, או מעכבות ריאגנטים תואמים; לפיכך, פישוט בידודו של אלה PTMs ארבע על חלבון המטרה להגדיל את העשרה PTM, ולבחון ביעילות crosstalk פוטנציאליים.

Protocol

1. הכנה לדוגמה: תרבית תאים מגדלים ארבעה לוחות 150 מ מ של תאים A431 ששינה הנשר של Dulbecco בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור בעובר. לגדול התאים A431 50% confluency. סרום להגביל את ארבעת הלוחות של תאים A431 עם סרום ללא DMEM במשך 24 שעות ביממה. פנקו שתי צלחות של תאים A431 עם 33.3 מ”ג/מ”ל של גורם הגדילה באפידרמיס עבור ח’ 1 תשאיר את שאר הצלחות שני לא מטופל.הערה: תא תנאי גידול וטיפול המוצגת כאן מספקים דוגמא; עם זאת, מתודולוגיה זו ישימה על רבים לסוגי תאים שונים ותנאי הטיפול. להכין blastR מאגרי פירוק ודילול כמקובל עם מעכבי (טבלה 1). משלבים מ 2.895 ל blastR פירוק מאגר µL 15 של טירוזין phosphatase מעכב, µL 30 deubiquitinase, מעכב deSUMOylase, µL 30 של היסטון deacetylase (HDAC) מעכב ו 30 µL של מעכב פרוטאז קוקטייל. משלבים mL 9.65 מאגר דילול blastR µL 50 של טירוזין phosphatase מעכב, µL 100 deubiquitinase deSUMOylase מעכב, 100 µL של היסטון מעכב deacetylase (HDAC), ואת µL 100 של מעכב פרוטאז קוקטייל.הערה: ראה טבלה של חומרים עבור הרכב מאגר מידע מעכב. יוצקים את התקשורת תרבות ולמקם את התאים על קרח. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מ ל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS). להסיר כמה שיותר PBS ככל האפשר לפני הוספת blastR מאגר פירוק כדי למקסם את פירוק התא.הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב. הוסף µL 600 blastR מאגר פירוק של כל צלחת 150 מ מ. הכמות של מאגר מבוסס על התשואה הצפויה חלבון (טבלה 2). Lyse התאים באמצעות המגרד של התא. Lysate יהפוך צמיגה עקב פירוק גרעיני. השתמש טיפ פיפטה כשתשמור 1 מ”ל להעביר את גולמי lysate לתוך מסנן blastR הונח צינור אוסף 15מל (איור 1). . הנה, משמש צינור בז 15 מ”ל. השתמש פומפה מסנן שסופקו לחלוטין לדחוס את המסנן blastR ולאסוף את lysate הזרימה דרך, כולל כל הבועות, צינור 15מל (איור 1). אופציונלי: העברת הבהיר lysate tube microcentrifuge 1.5 mL ו צנטריפוגה lysate כ- 10,000 x g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע צינור בז 15 מ”ל. לדלל את שקופה lysate עם blastR מאגר דילול לאמצעי הסופי של 3 מ עבור כל צלחת 150 מ מ. הכרך האחרון מבוסס על התשואה הצפויה חלבון (טבלה 2).הערה: שלב זה חשוב כמו ההרכב הסופי מאגר ישפיע לכתחילה התגובה של IP. Quantitate ריכוז חלבון (סעיף 2). 2. שיטת כימות הערה: לנצל assay כימות של חלבון ערכי צבע מוחלטים הסטנדרטי לקביעת חלבון כימות. כאן, כימות חלבון נקבע באמצעות דיוק חלבון מתקדם אדום וזמינותו. להוסיף 1 מ”ל של דיוק חלבון מתקדם אדום assay מגיב לכל אחד שני וואקום 1 מ”ל. µL מיקס 10 של מאגר פירוק blastR, µL 40 blastR דילול המאגר בצינור microcentrifuge mL 1.5 נקי על קרח.הערה: זה ישמש עבור קריאת הדגימה חלבון ריק. להוסיף 20 µL של המיקס מאגר פירוק/דילול (מתוך שלב 2.2) cuvette הראשון, שילוב על-ידי היפוך פעמיים עד שלוש פעמים. הוסף 20 µL של התא מדולל lysate (מתוך הניסוי) כדי cuvette השני, ערבוב לעיל. דגירה בדגימות עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. ספקטרופוטומטרים ריק עם הדגימה שילוב מאגר פירוק/דילול (מתוך שלב 2.3). למדוד את ספיגת מדגם lysate (מתוך שלב 2.4)-600 ננומטר. לקבוע ריכוז חלבון lysate כדלקמן:דוגמה הקריאה OD600 x 5 = ריכוז חלבון ב מ”ג/מ”להערה: קריאות OD מתחת 0.05 או מעל 0.5 קרובים הקיבולת טווח ליניארי של חלבון וזמינותו. עבור קריאות > 0.5, דגימות יכול להיות מדולל. עבור קריאות < 0.05, lysate יותר ניתן להוסיף דיוק חלבון מתקדם אדום assay הכימית (עד 50 µL). ראה טבלה 3 עבור מכפילי כדי להמיר ספקטרופוטומטרים קריאות ריכוז חלבון lysate מ”ג/מ”ל. אם יש חלבון מספקת בצלחת אחת, מומלץ להשתמש לוחות 2 או יותר לפי IP. במקרה זה, יהיה לקצור הצלחות בסדרה, מעביר את µL 300 המקורי של פירוק מאגר בין לוחות. על סמך ריכוז חלבון, לדלל מדגם עם שילוב מאגר (פירוק blastR חלק 1: 4 חלקים blastR דילול) כדי ריכוז הסופי הרצוי (בדרך כלל 1 mg/mL). הצמד להקפיא aliquots והמדגמים לא ישמש באופן מיידי. מאגר דגימות ב-70 מעלות צלזיוס. המשך סעיף 3. 3. Immunoprecipitation (IP) Assay הערה: חרוז ריכוזים זיקה, ריכוזי lysate ושעות הדגירה מומלצים הנחיות, עשויות להיות ייחודיות לכל חלבון המטרה או ספציפיים PTM נחקר. צינורות ריאגנט מניות ‘ היפוך ‘ המכיל Ub זיקה חרוזים, חרוזים זיקה pY, סומו זיקה 2/3 חרוזים ו Ac זיקה חרוזים מספר פעמים כדי לוודא החרוזים הם לגמרי resuspended בצינור. עבור כל IP assay, חרוז aliquot ההשעיה לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.5 נפרד על קרח (IP הצינור). כאן, להוסיף 20 µL של חרוזים זיקה אוביקוויטין, µL 30 phosphotyrosine זיקה החרוזים, 40 µL של SUMOylation 2/3 זיקה חרוזים או µL 50 של acetylation זיקה חרוזים בודדים mL 1.5 צינורות microcentrifuge על הקרח.הערה: ראה טבלה 4 עבור אמצעי האחסון המומלץ של חרוז השעיה לשימוש עבור כל חרוז זיקה. צינורות ריאגנט מניות ‘ היפוך ‘ המכיל ubiquitination IP שליטה חרוזים, חרוזים שליטה IgG מספר פעמים כדי לוודא החרוזים הם לגמרי resuspended בצינור. שליטה aliquot חרוזים לכל בקרת תגובת כדי לקבוע מחייב שאינם ספציפיים (שליטה IP הצינור). כאן, להוסיף 20 µL של חרוזים שליטה Ub, 30 µL של חרוזים שליטה pY, µL 40 של סומו שליטה 2/3 חרוזים או µL 50 של Ac שליטה חרוזים בודדים mL 1.5 צינורות microcentrifuge על הקרח.הערה: ראה טבלה 4 עבור אמצעי האחסון המומלץ של חרוז השעיה לשימוש עבור כל סוג של זיקה חרוז. לשמור כמות קטנה של lysate (20 µL) לפעול כפי תספיג קלט השליטה lysate. הוסף µL 5 5 x דוגמת המאגר, להרתיח ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב. הוסף lysate כל IP צינור, צינור IP שליטה. . הנה, 1 מ ג של lysate שימש לכל תגובה IP ושליטה, וכתוצאה מכך סכום כולל של 8 תגובות IP.הערה: 1.0 מ”ג של lysate לכל assay מומלצת כנקודת התחלה. הסכום של lysate יהיה צורך להשתנות בהתאם השפע של חלבון היעד שונה. דגירה הצינורות על פלטפורמה מסתובבת מעל קצה-ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. כאן, מסובב צינור ATR שימש במהירות 22. לאסוף חרוזים על ידי צנטריפוגה-3000-5000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. וארוקן את תגובת שיקוע רב ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים. רחץ חרוזים ב 1 מ”ל blastR מאגר לשטוף (מעכבי אינם הכרחיים בשלב זה) למשך 5 דקות על 4 ° C מסתובב פלטפורמה. לאסוף חרוזים על ידי צנטריפוגה-3000-5000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. וארוקן את תגובת שיקוע רב ככל האפשר מבלי להפריע את החרוזים. חזור על השלב לשטוף (שלבים 3.10-3.12) עוד פעמיים. לאחר השטיפה הסופית להסיר לחלוטין את מאגר תגובת שיקוע. הפרעה מזערית של בגדר חרוז מקובל (עד 5% הפסד). הסר תגובת שיקוע שיורית באמצעות קנס נשא חלבון טעינת עצה. הוסף µL 30 מאגר • תנאי חרוז, resuspend את החרוזים על ידי בעדינות הקשה/מצליף הצד של הצינור. אל תשתמש פיפטה בשלב זה.הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. בעדינות העבר ההשעיה חרוז כל עמודה ספין microcentrifuge 1.5 mL הונח צינור microcentrifuge 1.5 mL.הערה: מומלץ לבדוק בסוף את הטיפ פיפטה העברה להעברה עדינה אותך… צנטריפוגה ב-10,000 9,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאסוף את דגימת ה-IP. להוסיף 2 µL של מרקפטואתנול כל מדגם ומערבבים היטב.הערה: זה נוח להצמיד את המכסה העמודה ספין ולהשתמש זה קאפ הצינור אוסף עיבוד נוסף. במקום דגימות באמבט מים 95 ° C עבור מדגם לאסוף 5 דק על ידי צנטריפוגה-g x 10,000 עבור 1 דקות ב- RT. במידת הצורך, לאחסן דגימות ב-70 מעלות צלזיוס, לעצור כאן, או להמשיך לרוץ מרחביות-דף, העברה, וניתוח תספיג (סעיף 4). 4. תספיג ניתוח: זיהוי החלבון עניין דוגמאות נפרדות על-ידי dodecyl נתרן גופרתי לזיהוי בג’ל (מרחביות-עמוד) ולהעביר קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים מעבדה32. להשתמש של נוגדן ראשוני כדי לזהות את גרסאות post-translationally של החלבון עניין. כאן, PD-L1 נוגדן שימש כדי לזהות post-translationally ששונה PD-L1. השתמש chemiluminescence העדינה זיהוי ריאגנט לזיהוי.הערה: הכימית chemiluminescent אמור לשמש בשילוב עם התווית על-ידי HRP משני נוגדן מסוגלת לאתר נוגדן ראשוני. השתמש נפח של 2 מ של ריאגנט chemiluminescent לכל העברה mini-gel בגודל ממברנה (כ 8 x 7 ס”מ). לאחר דגירה עם נוגדן המשני המתאים (60 דקות ב RT מומלץ), לשטוף את האבן החשופה 6 x 10 דקות ב30 מ”ל תמיסת באגירה טריס עם tween-20 (TBST).הערה: ראה טבלה של חומרים עבור מאגר הרכב. מיד לפני השימוש, מערבבים 1 מ”ל של ריאגנט chemiluminescent A עם 1 מ”ל של ריאגנט chemiluminescent B (מספיק עבור ממברנה אחת 8 ס מ על 7 ס”מ). הוספת ריאגנט chemiluminescent ממברנה, דגירה עם נדנדה עדין-RT למשך 1-5 דקות לפני ויזואליזציה של האות חלבון באמצעות לסרטי רנטגן או תשלום מצמידים מכשיר (CCD) המצלמה הדמיה.הערה: דגירה קצר יותר, בתקופות הכימית chemiluminescent ייתכן שיהיה צורך שופע מאוד חלבונים.

Representative Results

היכולת של כלים אלה כדי לחקור PTM crosstalk על ידי גילוי ביעילות PTMs 4 אלה תלויה באופן חלקי מערכת מאגר ייחודי פירוק. המאגר denaturing blastR ביעילות מבודד חלבונים מכל התאים הסלולר באופן דומה מאגרי denaturing אחרים, אשר מבטיח פרופיל לחלבון מלא (איור 2 א). בנוסף, שומרת על אותות PTM מאוד יציב כמו סומו 2/3, אשר נחלש במהירות במאגרי denaturing כמו radioimmunoprecipitation assay (ריפה) (איור 2B). חשוב, כאשר מדולל כראוי, היא אינה משפיעה על שלמות ריאגנטים זיקה כמו מאגרי denaturing אחרים (למשל, מאגר Laemmli). משוכה משמעותית בעת עבודה עם מאגרי denaturing הוא היכולת להסיר ביעילות זיהום הדנ א הגנומי. המתודולוגיה קונבנציונאלי להפחתת צמיגות היא להטות את הדנ א באמצעות מחט מזרק או sonicating את הדגימה. איור 3A מראה זיהום דנ א גנומי בתא A431 lysate לאחר הטיפול עם BlastR מסנן, מחט מזרק או sonication. יש הסרה כמעט מלאה של הדנ א באמצעות המסנן ‘ BlastR ‘, אשר אינה המקרה באמצעות מחט מזרק קונבנציונאלי או sonication. זיהום דנ א גנומי באופן משמעותי משפיע על חלבון העברה דרך ג’ל אקרילאמיד מרחביות; עם זאת, טיפול עם המסנן BlastR מסיר דנ א גנומי, וכתוצאה מכך חלבון נאותה העברה (איור 3B). שינו נדידת הנגרמת על ידי זיהום הדנ א הגנומי יכול להשפיע באופן משמעותי על פרשנות של שהכלים המערבי; לדוגמה, התבנית EGFR מרוח ראיתי את הבלתי מסוננת lysate עשוי שדבריהן להתפרש כביטוי מוגברת יחסית המדגם מסוננים (איור 3C). על ידי ניצול מיטבי PTM העשרה וזיהוי במערכת זו, ניתן לקבוע במהירות אם חלבון המטרה משתנה על ידי אחד או יותר PTMs. החקירה של הפרופיל PD-L1 PTM לאחרונה בוצע בעזרת טכניקה זו, התוצאות הראו כי היה PD-L1 ubiquitinated, acetylated, טירוזין phosphorylated בתגובה EGF (איור 4). חשוב, נתונים אלה מדווחים שינויים PD-L1 PTM אנדוגני, אשר ייצג את אחוז קטן של PD-L1 הכולל מזוהה. איור 1: סינון DNA גנומי מתא lysate עם מסנן BlastR. מסנן תמונה של BlastR (א) . (B) Lysate נטען את המסנן בו הונח צינור אוסף 15 מ”ל. (ג) הבוכנה מושם לתוך המזרק, lysate מועברת דרך המסנן על-ידי דחיסה. (ד) לאסוף lysate, כולל כל הבועות באמצעות דחיסה מלאה. (ה) מסוננים lysate. איור 2: השוואה של מאגר פירוק BlastR כדי פירוק אלטרנטיבי מאגרי. איור 2A מ. Horita et al. 2017. Biosci. נציג. 31 (א) A431 התאים היו lysed עם BlastR ריפה, mPER, פירוק IP, Denaturing (1% מרחביות), ו Laemmli פירוק מאגרי. כל lysates denaturing היו DNA גנומי מוסר על-ידי מסנן BlastR. בידוד של חלבונים מן קרום, cytoplasmic, מיטוכונדריאלי, סמני גרעיני היו נחושים באמצעות נוגדנים נגד החלבונים סמן תא בהתאמה. (B) תאים A431 היו lysed עם BlastR, ריפה 1% מרחביות מאגר denaturing. Lysates היו immunoprecipitated עם הסומו 2/3 או פקד IgG זיקה חרוזים. הדגימות היו מופרדים על-ידי מרחביות-דף, נותחו על ידי תספיג באמצעות נוגדן 2/3-חזרת peroxidase (HRP) של סומו. נציג לחומה של N≥3 ניסויים עצמאית מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: BlastR פירוק סינון יעיל בהסרת הדנ א. (א) A431 התאים היו lysed עם מאגר פירוק denaturing. דנ א גנומי הוסר או לכסנתם עם מסנן BlastR, מחט מזרק או sonication 5, 10, 20 או 30 שניות. 2% lysate נותחה על ידי אתידיום ברומיד, agarose בג’ל. (B) Lysate מתאי A431 lysed עם מאגר denaturing לא מסונן או סינון עם המסנן ‘ BlastR ‘. דוגמאות הופרדו עם עמודים מרחביות, visualized באמצעות Coomassie הכתם. (ג) כפילויות דגימות B היו מופרדים על ידי עמודים מרחביות, הועבר PVDF, חלבון EGFR נבדקה באמצעות נוגדן EGFR. נציג שהכלים של N ≥ 3 ניסויים עצמאית מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: זיהוי של EGF-induced השינויים post-translational עבור PD-L1- איור מקורי Horita. et al. 2017. neoplasia30(א). סרום מוגבלת תאים A431 היו גם unstimulated (UT) או מגורה עם EGF למשך שעה אחת לפני פירוק עם מאגר פירוק BlastR. WCL נותחו עבור רמות PD-L1 (מסלולים 1, 2). אוביקוויטין איגוד חרוזים (UBA01) שימשו IP ubiquitinated חלבונים (נתיבים 3,4). חרוזים איגוד Phosphotyrosine (APY03) שימשו IP phosphorylated טירוזין חלבונים (נתיבים 5,6). סומו מחייב 2/3 חרוזים (ASM24) שימשו IP SUMOylated 2/3 חלבונים (נתיבים 7, 8). אצטיל ליזין איגוד חרוזים (AAC01) שימשו IP acetylated חלבונים (נתיבים 9,10). אג איגוד פקד חרוזים שימשו IP שאינם ספציפיים מחייבים חלבונים (נתיבים 11,12). דוגמאות היו מופרדים על-ידי מרחביות-דף, נותחו על ידי תספיג באמצעות נוגדנים PD-L1. אבן חשופה נציג מ- N ≥ 3 ניסויים עצמאית מוצג. כוכביות לבן שימשו לסימון PD-L1 pY ולהקות חלבון Ac. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. חישובים עבור מאגר פירוק BlastR 1.0 mL 2.0 mL 5.0 mL 10.0 mL מאגר BlastR פירוק 965 ΜL 1930 ΜL מ ל 4.825 מ ל 9.650 טירוזין phosphatase מעכב 5 ΜL 10 ΜL 25 ΜL 50 ΜL מעכב דה-ubiquitinase/דה-sumoylase 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL HDAC מעכב 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL מעכב פרוטאז קוקטייל 10 ΜL 20 ΜL 50 ΜL 100 ΜL חישובים עבור מאגר דילול BlastR מ ל 4.0 8.0 mL 20.0 מ”ל 40.0 מ מאגר BlastR פירוק 3.86 mL 7.72 mL 19.3 mL 38.6 mL טירוזין phosphatase מעכב 20 ΜL 40 ΜL 100 ΜL 200 ΜL מעכב דה-ubiquitinase/דה-sumoylase 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL HDAC מעכב 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL מעכב פרוטאז קוקטייל 40 ΜL 80 ΜL 200 ΜL 400 ΜL טבלה 1: פירוק ודילול כמקובל מאגר הכנת תרשים- תרשים מתן ריכוזים של מעכבי להוסיף עבור פירוק ודילול כמקובל מאגר נפח נתון בעת הכנת אנשים רגילים עבור פירוק התא. תכולת החלבון צלחת נפח BlastR פירוק מאגר מומלצים נפח BlastR דילול מאגר מומלצים < 1 מ ג שילוב החלבון של לוחות מרובים כדי להפוך את נפח סופי 1.5 mL 1-2 מ ג 300 ΜL כדי להפוך את נפח סופי 1.5 mL 2-4 מ ג 600 ΜL להכין 3 מ”ל נפח סופי 4-6 מ ג 900 ΜL כדי להפוך 4.5 מ”ל נפח סופי בטבלה 2: BlastR פירוק/דילול מאגר תרשים. תרשים מתן מומלץ פירוק ומסוג מאגר דילול בעת קבלת lysate. נפח תא lysate להוסיף 1 מ”ל של ריאגנט דיוק אדום חלבון Assay (µL) מכפיל לשימוש עם דגימת קריאה OD600 10 10 20 5 30 3.3 40 2.5 50 2 טבלה 3: מכפילי כדי להמיר ספקטרופוטומטרים קריאות מ”ג/מ”ל Lysate. תרשים מתן המרת מספרים עוזרו עם חישוב ריכוז חלבון. זיקה חרוזים נפח של חרוז slurry/IP (mL) Ubiquitination 20 Phosphotyrosine 30 SUMOylation 2/3 40 Acetylation 50 שליטה חרוזים נפח של חרוז slurry/IP (mL) Ubiquitination הבקרה חרוזים 20 Phosphotyrsoine הבקרה חרוזים 30 SUMOylation 2/3 שליטה חרוזים 40 Acetylation הבקרה חרוזים 50 בטבלה 4: מומלץ נפח של חרוזים/IP תרשים. תרשים מתן מומלץ כמויות של זיקה חרוזים לשימוש לכל תגובה IP.

Discussion

גישות הראשונית כדי לקבוע אם חלבון המטרה משתנה מאת PTM יכול להתבצע באמצעות הנוגדן הספציפי של חלבון המטרה עבור IP, ואחריו תספיג עם נוגדן PTM (למשל., אנטי-אצטיל ליזין), או באמצעות נוגדן PTM עבור ה-IP, ואחריו תספיג עם היעד חלבון נוגדן ספציפי30,31,33. בעוד שתי הגישות עבודה תיאורטית, ניצול של נוגדן חלבון-במטרה יש מוקשים פוטנציאליים נוספים, כגון הנוגדן לא ייתכן IP תואמים, או שינויים PTM גדול עלול לחסום את האתר זיהוי נוגדנים על חלבון המטרה34 ,35. היתרון של חרוזים זיקה PTM הוא כי התחומים נוגדן או איגוד במיוחד להכיר את PTM עניין; לפיכך, שינויים חלבון המטרה לא צריכים לשנות את זיהוי על ידי החרוזים זיקה. לדוגמה, Ub PD-L1 זוהה עם טכניקה המתוארת כאן, שני אנדוגני מונו – ו פולי-Ub נצפתה (איור 4). פרסום אחרונים מאת Lim ואח. מנוצל במבחנה Ub טכניקות לחקור PD-L1 Ub, התוצאה הייתה דומה מאוד התוצאות שמוצג באיור 436. מעניין, הם גם הופיע IP עם נוגדן PD-L1 להעשיר PD-L1 מתא lysate, Ub היה overexpressed ואיפה MG-132 נוספה כדי להגביר את האות. התבנית Ub לא היה מאוד ברורים מהתבנית במבחנה Ub ועמיד. חקירת אנדוגני Ub PD-L1 במודלים התרבות התא לא בוצעה Lim ואח. דוח כדי להבהיר את ההבדל בין נתוני תרבות, במבחנה שלהם בתא.

חוקרים אם חלבון הוא שונה מאת PTM עשויה להיות מאתגרת, בשל שפע נמוכה שלה אופי חולף37,38, ומחייבת בדרך כלל העשרה דרך IP. יעילות ה-IP של PTMs דורש אופטימיזציה של מספר שלבים מרכזיים, ריאגנטים, כגון פירוק מאגרי ריאגנטים זיקה. כאשר חוקרים PTMs מרובים של חלבון המטרה, מגביר אופטימיזציה הנדרשים הסבירות. ניצול מערכת פירוק blastR הוא שלב קריטי של פרוטוקול זה, כפי שהוא שומר על יכולת ה-IP חזקים, תוך הפעלת PTM זיהוי של pY, סומו 2/3, Ub, Ac PTMs במערכת אחת. טכניקה זו ממטבת את הזמן והמשאבים הנדרשים כדי לקבוע אם חלבון ביעד מסוים הוא שונה על-ידי אלה PTMs ארבעה, ואת פוטנציאל מספק תמונה טובה יותר של PTM crosstalk ביחס השוואת תוצאות PTM המבוצעת באמצעות פירוק מערכות מרובות. החקירה של התאימות של המערכת פירוק blastR עם PTMs חלופיים, כמו גליקוזילציה, בוצעו; עם זאת, זה לא נבדקה בדקדקנות לכל סוגי PTMs.

שופע הדנ א הגנומי יכול להתערב עם מדידות חלבון באמצעות ערכי צבע מוחלטים או שיטות nanodrop, להשפיע על ההעברה של חלבונים ב- ג’ל אקרילאמיד מרחביות, ולמנוע אינטראקציה מטריקס חלבון ואהדה במהלך מבחני ה-IP. השיטה המתוארת כאן מנצל מסנן מיוחדים כדי להסיר זיהום דנ א גנומי, המהווה צעד קריטי נוסף של פרוטוקול זה. כדי להדגיש נקודה זו, בוצעו בדיקות צמיגות לפני ואחרי טיפול סינון blastR, התוצאות הראו ירידה של צמיגות גבוהה כדי צמיגות של מים (נתונים לא מוצג). שינוי זה צמיגות נתמכה על ידי התוצאות איור 3, מציג שכמעט כל ה-DNA גנומי הוסרו. חשוב, ה-DNA הוא לא לכסנתם בשיטה זו, כפי דנ הוטו לא ייתפס על ידי המסנן (נתונים לא מוצג). כלי זה הוא על שיטות קונבנציונליות, כמו sonication או מזרק-DNA-חיתוך, מכיוון שזה דורש אין ציוד מיוחד, מאוד לשחזור, מסיר את הדנ א במקום הטיה זה. יתר על כן, זה לא תגרע חלבון ב- lysate, אשר יכול להתרחש תוך שימוש בשיטות המקובלות29. ניצול למסנן לוקח 5-30 שניות עבור דגימה לעומת שיטות אלטרנטיביות עשוי להימשך דקות אחדות (קרי, מזרק הטיה) ואיפה יכול לגרום מדגם הטרוגניות כמו DNA מזהמים נשארים lysate פירוק יעיל של ה-DNA. ניתוח מקיף של הסינון blastR מראש, שלאחר lysate בוצעה, ו אין הבדל הנצפה בפרופיל חלבון נצפתה על ידי Coomassie, במטרה המערבי, או הכולל, במטרה PTM ניתוחים; לפיכך, השלמות של פרופיל החלבון עשוי לא הושפעו על-ידי סינון החוצה את הדנ א הגנומי. בסופו של דבר, מערכת סינון זו היא מועילה לכל המערבי או יישום ה-IP קיים ואיפה עשוי להשפיע על פרשנות של חלבון ניתוח הדנ א.

חשוב לציין שיש פוטנציאל לגילוי שלילי כוזב, טכניקה זו, אשר עשוי להיות בחלקו בשל זיקה חרוז רוויה, הפרעות באתר איגוד או PTM מיסוך. למשל, חלבון המטרה מסוים ניתן לשנות על ידי Ac ברמות נמוכות מאוד; לכן, זה עשוי לא להיות מבודדת על ידי פאן-אצטיל ליזין זיקה חרוזים ושרויה שופע יותר חלבונים היעד Ac-השתנה. לימודי מתמשך מבוצעות כדי להעריך את גבולות זיהוי ריאגנטים זיקה מנוצל פרוטוקול זה, אבל פרסום האחרונות מציע מגבלה זיהוי מאוד חזקים. הנתונים הראו כי טכניקה זו יכולה לזהות גם מולקולות חלבון המטרה acetylated 17 לכל תא31בהיקף. ובכל זאת, בנסיבות מסוימות כגון תאים הקלד ירידה לפרטים, PTMs ארעי בתגובה לגירויים ספציפיים, או מיסוך של PTMs עקב אינטראקציית חלבון עשוי לגרום כל תוצאות שליליות שגויות. אלה ממלכודות הפוטנציאל של טכניקה זו, כמו גם רוב שיטות PTM IP. לפיכך, מומלץ לאשר את התוצאות תוך שימוש בגישות מרובים.

שינויים כמו גליקוזילציה זרחון הוכחו להתחרות על חומצות אמינו דומה39,40, ו PTMs אחרים כמו ubiquitination, זרחון הוכחו לעבוד ברצף כדי לווסת של חלבון הפונקציה17,41. עבודה על neuropathological חלבון טאו הדגיש את חשיבות crosstalk PTM, איפה טאו hyper-זרחון SUMOylation טאו משופרת השני42. יתר על כן, קבוצה זו הראה כי SUMOylation של טאו למנוע פולי-Ub והשפלה טאו עוקבות, שיכול להוביל צבירה. זהו אחד של דוגמאות רבות של הרגולציה crosstalk PTM, השירות של טכניקה זו יעזור להאיר את החשיבות של PTMs ואת crosstalk שלהם בוויסות חלבונים מפתח על בריאות ומחלה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים מדענים מחקר inc. שלד התא, ד”ר בריאן הובר, אשלי דיוויס על שלהם ביקורת ועריכה של דיונים פוריים על כתב היד. בנוסף, אנו מודים ד ר רוברט Hom על תרומתו במהלך הייצור של כתב היד וידאו. עבודה זו נתמכה על ידי מימון inc. שלד התא

Materials

Cell lysis/genomic DNA removal and analysis
1x phosphate buffered saline (PBS) common buffer Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR lysis buffer Cytoskeleton Inc. BLST01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) common buffer Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal
Mammalian protein extraction reagent (mPER) Thermofisher 78503 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Immunoprecipitation (IP) Lysis Pierce 87787 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer common buffer Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli common buffer Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue
BlastR dilution buffer Cytoskeleton Inc. BDB01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Protease Inhibitor Cocktail Cytoskeleton Inc. PIC02
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) Cytoskeleton Inc. NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide Cytoskeleton Inc. TSA01
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) Cytoskeleton Inc. PYI01
cell scrapers Costar 3008
BlastR Filter Cytoskeleton Inc. BLR02
BD Insulin syringe needle BD 08290-3284-11
sonicator (Branson Sonifier) Branson Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent Cytoskeleton Inc. ADV02
1 mL cuvettes Fisher 14955127
Spectrophotometer (Genesys20) Thermofisher 4001 Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration
Agarose Fisher BP1356-500
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder NEB N3232L
DNA gel box Thermofisher 7312 B1A
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer common buffer Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA
PTM Immunoprecipitation
Phosphotyrosine beads Cytoskeleton Inc. APY03-beads
Ubiquitination beads Cytoskeleton Inc. UBA01-beads
SUMOylation 2/3 beads Cytoskeleton Inc. ASM24-beads
Acetylation beads Cytoskeleton Inc. AAC04-beads
Phosphotyrosine control beads Cytoskeleton Inc. CIG01-beads
Ubiquitination control beads Cytoskeleton Inc. CUB02-beads
SUMOylation 2/3 control beads Cytoskeleton Inc. CIG01-beads
Acetylation control beads Cytoskeleton Inc. CIG02-beads
BlastR wash buffer Cytoskeleton Inc. BWB02 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
Bead elution buffer Cytoskeleton Inc. BEB01 Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives
microcentrifuge Eppendorf 5417 Other microcentrifuges can be used 
tube rotator ATR RKVSD Other end-over-end tube rotators can be used 
protein loading tips VWR 37001-150
spin columns Cytoskeleton Inc. SPN22
heat block 95 °C Benchmark BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x sample buffer common buffer recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels Invitrogen XP04200BOX The large wedgewells are excellent for loading large volumes
1x Running buffer common buffer recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS
seeblue protein ladder Life Technologies LC5625
electrophoresis cell Invitrogen Xcell surelock electrophoresis cell Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels 
power supply Biorad PowerPac HC Other power supplies can be used 
1x Transfer buffer common buffer recipe: Tris-HCl, glycine, methanol
Transfer cell Biorad mini trans-blot cell Other transfer cells can be used 
Immobilon- P membranes (PVDF) millipore IPVH 304F0
non-fat milk thrive 813503015095
Tris buffered saline with tween (TBST) common buffer recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemiluminescent Detection Reagent Cytoskeleton Inc. CLRA/CLRB
Cell growth and treatment
Dulbecco's Modified Eagle's medium  ATCC 30-2002
Fetal bovine serum ATLAS  F-0500-A 
Epidermal growth factor Cytoskeleton Inc. CN02-A
150 mm cell culture plates Corning 430599
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  2. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
  3. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
  4. Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
  5. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
  6. Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
  7. Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
  8. Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20 (2013).
  9. Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
  10. Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
  11. Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
  12. Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
  13. West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
  14. Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
  15. Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
  16. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
  17. Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
  18. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
  19. Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
  20. Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
  21. Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
  22. Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
  23. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  24. Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
  25. Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
  26. Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
  27. Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
  28. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
  29. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
  30. Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
  31. Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
  32. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  33. Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
  34. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  35. Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
  36. Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
  37. Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
  38. Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
  39. Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins–a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
  40. Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
  41. Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
  42. Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).

Tags

ImmunoprecipitationPTMPost-translational ModificationCell SignalingLysateBlaster FilterProtein QuantitationA431 CellsLysis BufferDNA Removal

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Horita, H., Law, A., Middleton, K. Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins. J. Vis. Exp. (131), e56912, doi:10.3791/56912 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image