標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

1. 前処理: 細胞培養 ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清を添加した A431 細胞の 4 つの 150 の mm プレートを成長します。 50% の confluency に A431 細胞を成長します。 血清は、24 時間無料の血清 DMEM に A431 細胞の 4 つのプレートを制限します。 1 h. まま放置されて他の 2 つのプレートは、33.3 mg/ml の表皮の成長因子の A431 細胞の 2 つのプレートを扱います。注: ここに示すセル成長および治療条件提供例;ただし、この方法は、多くの異なる種類の細胞、処理条件に適用されます。 BlastR 阻害剤 (表 1) 溶解と希釈バッファーを準備します。チロシン脱燐酸化酵素阻害剤、脱ユビキチン化酵素 deSUMOylase 阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤 30 μ と 30 μ L のプロテアーゼ抑制剤のカクテルの 30 μ L の 15 μ L と blastR 換散バッファーの 2.895 mL を組み合わせます。 チロシン脱燐酸化酵素阻害剤、脱ユビキチン化酵素 deSUMOylase 阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の 100 μ L とプロテアーゼ阻害剤のカクテルの 100 μ L の 100 μ L の 50 μ L で 9.65 mL の blastR 希釈バッファーを組み合わせます。注: バッファー組成と阻害剤については、材料の表を参照してください。 培地を注ぎ、氷の上のセルを置きます。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 10 mL で 2 回細胞を洗います。 セル換散を最大限に blastR 換散バッファーを追加する前にできるだけ多くの PBS を削除します。注: バッファー組成材料の表を参照してください。 各 150 mm 板 blastR 換散バッファーの 600 μ L を追加します。バッファーの量は、予想される蛋白質収量 (表 2) に基づいています。 細胞スクレーパーを使用して細胞を溶解させます。ライセートは、核溶解による粘性になります。 切り取られた 1 mL ピペット チップを使用すると、15 mL コレクション チューブ (図 1) に配置されている blastR フィルターに原油のライセートを転送します。ここでは、15 mL の隼の管が使用されます。 完全、ライセート通過、15 mL チューブ (図 1) で任意の気泡を含む収集 blastR フィルターを圧縮して指定されたフィルター プランジャーを使用します。 (省略可能) 転送明らかに 1.5 mL 遠心チューブ、4 ° C で 1 分間遠心する約 10,000 x g でライセート ライセート 上清を新しい 15 mL ファルコン チューブに転送します。 明らかにし希釈 lysate blastR 希釈バッファー 150 mm の板をそれぞれ 3 mL の最終巻。最終巻は、予想される蛋白質収量 (表 2) に基づいています。注: この手順は、最後のバッファー組成は IP 反応を厳密に影響を与えることが重要です。 蛋白質の集中 (セクション 2) 量的に表わします。 2. タンパク質定量分析 注: は、タンパク定量法を決定するための標準的な比色タンパク質定量分析を利用します。ここでは、タンパク定量法は、精度赤高度な蛋白質の試金を使用して決定されます。 2 つの 1 mL キュベットのそれぞれに精度赤高度な蛋白質の試金の試薬の 1 つの mL を追加します。 BlastR 換散バッファーの氷の上のきれいな 1.5 mL 遠心チューブに blastR 希釈バッファーの 40 μ L ミックス 10 μ L。注: これは、空白の蛋白質のサンプルを読んで使用されます。 2 〜 3 倍の反転によって最初のキュベットとミックスに (手順 2.2) から溶解/希釈バッファー ミックスの 20 μ L を追加します。 希薄化後の細胞ライセートの 20 μ L を追加 (実験) から上記のように 2 番目のキュベットに混合します。 部屋の温度で 1 分のサンプルをインキュベートします。 空白分光光度計 (ステップ 2.3) から溶解/希釈バッファー ミックス サンプル。 600 (ステップ 2.4) からライセート サンプルの吸光度を測定 nm。 とおり; ライセート タンパク質濃度を測定します。外径600 x 5 を読んでサンプル = mg/mL の蛋白質の集中注: OD 測定値 0.5 以上 0.05 以下が蛋白質の試金の線形範囲容量の近くにあります。測定値 > 0.5、サンプルを希釈することができます。朗読の < 0.05、ライセートより精度赤高度な蛋白質の試金の試薬 (最大 50 μ L) に追加できます。分光光度計の測定値を mg/mL 溶解液のタンパク質濃度に変換する乗算器係数の表 3を参照してください。一皿で十分なタンパク質がある場合は、IP あたり 2 つ以上のプレートを使用することをお勧めします。この場合、板はシリーズは、プレート間の換散バッファーの元の 300 μ L を転送する収穫されます。 バッファーでサンプルを希釈タンパク質濃度に基づいて、(1部 blastR 換散: 4 つの部分 blastR 希釈) 希望最終濃度 (通常 1 mg/mL) に。 すぐには使用されませんのサンプルの因数に凍結します。 -70 ° C で試料を保存します。 セクション 3 に進んでください。 3. 免疫沈降 (IP) アッセイ 注: アフィニティ ビーズ濃度、溶解液の濃度、インキュベーション時間が推奨ガイドライン、およびターゲット蛋白質および調査されている特定の PTM ごとに一意であることがあります。 Ub アフィニティ ビーズ、pY アフィニティ ビーズ、相撲 2/3 アフィニティ ビーズ、Ac アフィニティ ビーズにビードが完全にチューブで再停止されることを確認する数回を含む試薬ストック チューブを反転します。 各 IP 試金のため、氷上 (IP チューブ) 別 1.5 mL 遠心チューブに分注ビーズ懸濁液。ここでは、氷の上の個々 の 1.5 mL 遠心チューブにユビキチン アフィニティ ビーズの 20 μ L、ホスホチロシン アフィニティ ビーズの 30 μ L、sumo 化 2/3 アフィニティ ビーズ 40 μ L またはアセチル化アフィニティ ビーズの 50 μ L を追加します。注: 各アフィニティ ビーズに使用するビーズ懸濁液の推奨されるボリュームの表 4を参照してください。 ユビキチン化 IP コントロール ビーズと IgG コントロール ビーズにビードが完全にチューブで再停止されることを確認する数回を含む試薬ストック チューブを反転します。 非固有のバインド (コントロール IP チューブ) を決定するコントロール反応あたり因数管理ビーズ。ここでは、氷の上の個々 の 1.5 mL 遠心チューブに Ub コントロール ビーズの 20 μ L、pY コントロール ビーズの 30 μ L、相撲 2/3 コントロール ビーズ 40 μ L または Ac コントロール ビーズの 50 μ L を追加します。注: は、アフィニティ ビーズの種類ごとに使用するビーズ懸濁液の推奨されるボリュームの表 4を参照してください。 少量溶解液 (20 μ L) 西部のしみのライセート制御入力を実行するを保存します。5 x サンプルバッファーの 5 μ L を追加し、95 ° C、5 分で沸騰します。注: バッファー組成材料の表を参照してください。 各 IP 管と制御 IP チューブに lysate を追加します。ここでは、8 IP 反応の合計で、ip アドレスとコントロールの反応あたりライセートの 1 mg が使用されました。注: 開始点としてには、アッセイごとライセートの 1.0 mg の使用をお勧めします。ライセート必要となります量変更されたターゲット蛋白質の豊富さによって異なります。 2 h の 4 ° C でエンド オーバー エンド回転プラットフォーム上管を孵化させなさい。ここでは、ATR チューブ腱板は速度 22 で使用されました。 4 ° C で 1 分の 3,000-5,000 × g で遠心分離してビーズを収集します。 ビーズを乱すことがなく、できるだけ多くの上澄みを離れて吸い出しなさい。 1 mL blastR 回転台 4 ° C で 5 分間洗浄バッファー (この段階では、阻害剤を必要ありません) でビーズを洗浄します。 4 ° C で 1 分の 3,000-5,000 × g で遠心分離してビーズを収集します。 ビーズを乱すことがなく、できるだけ多くの上澄みを離れて吸い出しなさい。 洗浄の手順 (手順 3.10 3.12) 2 回以上。 最終的な洗浄後バッファー上清を完全に削除します。ビーズ ペレットの最小限は (最大 5% の損失です)。罰金を使用して削除残留清は、蛋白質チップの読み込みを退屈させます。 ビーズ溶出バッファーの 30 μ L を追加し、軽くタップ/フリック管の側でビードを再停止しなさい。この段階では、ピペットを使用しないでください。注: バッファー組成材料の表を参照してください。 5 分間室温でインキュベートします。 軽く各ビーズ懸濁液を 1.5 mL 遠心チューブに配置されている 1.5 mL 容マイクロ スピン列に転送します。注: 穏やかな転送の転送ピペット チップの端を切り取ることをお勧めします。 IP サンプルを収集するために部屋の温度で 1 分間 9,000-10,000 × g で遠心分離機します。 各サンプルに 2-メルカプトエタノールの 2 μ L を加え、よく混ぜます。注: 回転カラムのふたをスナップし、さらに処理するためのコレクション チューブをキャップにこれを使用すると便利です。 室温 1 分 10,000 × g で遠心分離によって 5 分収集サンプルの 95 ° C の水浴中サンプルを配置します。 必要に応じて、-70 ° C で試料を保存ここに停止や SDS-PAGE、転送、および西部のしみの分析 (セクション 4) 実行に進みます。 4 西部のしみの分析: 興味の蛋白質の同定 ナトリウム ドデシルによって別のサンプルは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を硫酸し、標準的な実験室のプロトコル32によるとポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転送。 一次抗体を使用すると、興味の蛋白質のファーストクリーニング改変されたバージョンを検出できます。ここでは、PD L1 抗体はファーストクリーニング変更された PD L1 を検出する使用されました。 検出用超高感度化学発光検出試薬を使用します。注: 化学発光試薬は一次抗体を検出できる HRP 標識二次抗体と組み合わせて使用する必要があります。 化学発光試薬ミニ gel サイズ転送膜 (約 8 × 7 cm) あたり 2 mL の量を使用します。 適切な二次抗体の孵化後 (RT で 60 分お勧め)、tween 20 (TBST) とトリス緩衝生理食塩水 30 mL で 6 x 10 分しみを洗います。注: バッファー組成材料の表を参照してください。 直前に使用、化学発光試薬 B (1 つ 8 × 7 cm 膜の十分な) 1 mL と化学発光試薬 A の 1 mL を混ぜます。 膜化学発光試薬を追加し、x 線フィルムまたは電荷結合素子 (CCD) カメラ画像を用いた蛋白質信号の可視化の前に 1-5 分の RT で穏やかな揺動と孵化します。注: 化学発光試薬のインキュベーション時間の短縮は非常に豊富なタンパク質必要かもしれません。