Роман в Vitro раны исцеления Assay для оценки миграции клеток
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки воздействия пептидов на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Этот метод позволяет для быстрого и высокую воспроизводимость получения количественных данных на скорость миграции и раны закрытия клеток.
Abstract
Цель этой работы заключается в том, чтобы показать новый метод для оценки способности некоторых иммуномодулирующих молекул, например антимикробных пептидов (AMPs), чтобы стимулировать миграцию клеток. Важно отметить, что миграция клеток является событием ограничения скорости во время процесса заживления раны, чтобы восстановить целостность и нормальной функции слоев ткани после травмы. Преимущество этого метода над классической assay, которая основана на вручную сделал нуля в монослое клеток, является использование культуры специальных силиконовых вставок предоставление двух отсеков для создания псевдо-рану поля свободной ячейки с четко определенной ширины (500 мкм ). Кроме того благодаря автоматизированной изображения анализ платформы, можно быстро получить количественные данные о скорости закрытия и ячейки миграции рану. Более точно будет показан эффект двух лягушка кожи усилителей на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Кроме того Предварительная обработка этих клеток с специфичные ингибиторы представит информацию о молекулярных механизмов, лежащих в основе таких событий.
Introduction
Основном, известно, что заживление ран в животных является основополагающим процесс для восстановления целостности и нормальной функции слоев ткани после травмы1. Несмотря на эпителиальные поверхности, подвергшихся воздействию внешней среды (например, кожи, органов дыхания и желудочно-кишечного тракта) образуют защитный барьер от физических и химических оскорбления, формирование раны может легко произойти, особенно после операция или микробной инфекции2. В качестве примера колонизации легочной ткани, оппортунистических бактериальных патогенов Pseudomonas aeruginosa, особенно в страдающих кистозный фиброз (CF), приводит к повреждению эпителия дыхательных путей с последующим дыхательной недостаточности3, 4. Заживление ран — это сложный узел ремонт механизм для восстановления нормальной архитектура пораженных тканей5. Он характеризуется начальной воспаления, последовал период регенерации эпителизации, ангиогенез и тканей ремоделирования с коллагена и ячейки дифференциация6,7,8 . Для обеспечения целостности эпителиальных и контролировать распространение микробов, все живые организмы производят молекулы обороны, включая антимикробных пептидов (AMPs)9,10. Процесс заживления очень трудно имитировать в пробирке из-за недостатка клеток мусора и сложного взаимодействия различных типов клеток. Однако в пробирке способности пептидной ускорить закрытие псевдо-раны, стимулируя миграцию эпителиальных клеток свидетельствует о ее способности исцелять скомпрометированных эпителия. Действительно миграции клеток является событием ограничения скорости в заживлении ран, и изучение факторов, которые могут повлиять на миграцию клеток поможет для целевой терапии для улучшения заживления ран.
Здесь высоко воспроизводимых экспериментальных пробирного предоставляется на основании специальных силиконовых вставок культуры для оценки миграции клеток в пробирке. Он основан на создании разрыв 500 мкм (псевдо-раны) на вырожденная клетки однослойная. Клетки на краю искусственные поля «раненый» начнется переход в ячейку свободно OBLASTь, формирование новых клеток контакты. Культуры вставка представляет собой новый инструмент для быстрого заживления экспериментов. Предоставляются два водохранилища, разделенных стеной 500 мкм, и они могут быть надлежащим образом размещены в 3-см блюдо тарелку или в колодец 12-ну плиты. Заполнение каждого отсека вставки с суспензию клеток позволяет клеткам расти в каждой области, назначенные до слияния, в то время как удаление Вставка породит чистой сотовый бесплатно разрыв примерно 500 мкм (равна ширине разделительной стены). Надлежащего клеток питательной среды, дополнена тест соединения можно добавить в блюдо пластины/хорошо. После разрыва могут быть визуализированы в разные временные интервалы под инвертированным микроскопом, желательно один, оснащены видео камеры для захвата изображений. Наконец измерение изменений в области охватывает ячейки по программе анализа веб-автоматизированных изображения позволит количественная оценка скорости закрытия и ячейки миграции рану. В целом этот метод является шагом вперед в отношении классических assay, где нуля производится вручную промо вырожденная клеток монослои стерильной иглой или пипетки Совет11. Действительно, последняя процедура может разрушить пластиковые дно тарелки пластины/Ну и покрытия, создавая морщины. Кроме того «раненых» область не имеет четко определенной ширины по всей длине разрыв, как это сильно зависит от давления исследователями на кончик иглы. Кроме того выбили клетки могут образовывать сгустки живых и мертвых клеток на краях нуля; Кроме того распространение живых клеток в область «раненый» может помешать скорость миграции клеток, генерации невоспроизводимых результатов12.
Кроме того благодаря нуля изображения анализ платформы, пользователи могут быстро получить (в течение нескольких минут) количественные данные о миграционных поведение отдельных клеток без необходимости приобретения дополнительного программного обеспечения. Эта платформа способна анализа фазы контраст микроскопии изображений низкого (~ 5 X), средний (~ 10 X) и высокой (~ 20 X) увеличение. После загрузки zip-файл изображений (в *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff формат) для создания файла резюме, который показывает процент клеток охватывает районы и скретч областях, а также скорость ячейки автоматически проводится анализ миграция, на различных временных интервалах.
В этой работе, с помощью AMP-производная лягушка кожи, т.е. Esc(1-21) и его diastereomer Esc(1-21) – 1 c13и бронхиальной клеточная линия, выражая функциональные CF трансмембранной проводимости регулятор (МВТР)14,15, предоставляется пример пептид индуцированной клеток миграции по сравнению с необработанной (управления) образцов. Обратите внимание, что эпителия дыхательных путей и МВТР играть решающую роль в поддержании функции легких и ранение ремонт16. Кроме того, с помощью селективных ингибиторов (например, AG1478)17 рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), доказательства того, что миграция бронхиальной клеток, вызванные вышеупомянутыми пептиды включает активацию EGFR12, 18 сообщается.
В резюме цель этой процедуры заключается в том, чтобы показать, как использование таких силиконовые вставки культура представляет собой быстрый и легко доступный пробирного для точного определения миграции адэрентных клеток (например, бронхиальной эпителиальных клеток) и молекулярной механизмы контроля таких событий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клетки миграция является важным процессом во многих физиологических и патологических мероприятиях, включая заживление ран, развития эмбриона и метастазов рака. Основная процедура для изучения клеток миграции в пробирке включает в себя: (i) создание монослое клеток, (ii) производств…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансирование от университета Ла Сапиенца и итальянский фонд исследований кистозный фиброз (проект FFC #11/2014 принят делегациями FFC от Сиены, Валчиавенна Sondrio, Череа Il Sorriso ди Дженни и Павии). Частью этой работы также было поддержано в Филы Филы Prot. Грант-RU-2014-1020.
Мы благодарны доктора Лоретты Ferrera (U.O.C. генетики Медика, Istituto Giannina Gaslini, Генуя, Италия) для предоставления бронхиальной эпителиальных клеток.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
References
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
