Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire
Summary
Nous présentons ici un protocole visant à évaluer l’effet des peptides sur la migration des cellules épithéliales bronchiques. Cette méthode permet l’obtention rapide et hautement reproductible des données quantitatives sur la vitesse de fermeture de migrations et de la blessure cellulaire.
Abstract
Le but de ce travail est de montrer une nouvelle méthode pour évaluer la capacité de certaines molécules immunomodulatrices, tels que des peptides antimicrobiens (ampères), pour stimuler la migration cellulaire. Ce qui est important, la migration cellulaire est un événement limitante au cours du processus de cicatrisation de rétablir l’intégrité et le fonctionnement normal des couches de tissus après une blessure. L’avantage de cette méthode sur l’analyse classique, qui est basé sur une rayure faite manuellement en une monocouche de cellules, est que l’utilisation de la culture de silicone spécial insère fournissant deux compartiments pour créer un champ de Pseudo-plaie acellulaire avec une largeur bien définie (500 μm ). En outre, en raison d’une plateforme d’analyse automatique d’image, il est possible d’obtenir rapidement des données quantitatives sur la vitesse de la plaie fermeture et la migration cellulaire. Plus précisément, l’effet des deux amplis de peau de grenouille sur la migration des cellules épithéliales bronchiques s’affichera. En outre, un prétraitement de ces cellules avec des inhibiteurs spécifiques vous renseignera sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent de tels événements.
Introduction
Il est largement connu que la cicatrisation des plaies chez les animaux est un processus fondamental de rétablir l’intégrité et le fonctionnement normal des couches de tissu après blessure1. Malgré les surfaces épithéliales exposés à l’environnement externe (par exemple, la peau, appareil respiratoire et digestif) forment une barrière protectrice des injures physiques et chimiques, la formation des plaies peut facilement se produire, surtout après une intervention chirurgicale ou infections microbiennes2. À titre d’exemple, la colonisation des tissus pulmonaires par la bactérie pathogène opportuniste, Pseudomonas aeruginosa, en particulier dans les personnes souffrant de fibrose kystique (FK), conduit aux dommages de l’épithélium des voies respiratoires avec une insuffisance respiratoire qui en résulte3, 4. La cicatrisation est un mécanisme de réparation complexes hôte pour restaurer l’architecture normale d’un tissu lésé5. Elle est caractérisée par une inflammation initiale, suivie d’une phase de régénération qui englobe l’épithélialisation, angiogenèse et transformant le tissu avec la production de collagène et cellulaire différenciation6,7,8 . Pour garantir l’intégrité épithéliale et de contrôler la prolifération microbienne, tous les organismes vivants produisent des molécules de défense, y compris les peptides antimicrobiens (ampères)9,10. La processus de cicatrisation est très difficile de simuler in vitro en raison de l’absence de débris cellulaires et des interactions complexes entre les différents types de cellules. Toutefois, la capacité in vitro d’un peptide d’accélérer la fermeture d’une Pseudo-plaie de en stimulant la migration des cellules épithéliales est révélateur de sa capacité à guérir un épithélium compromis. En effet, la migration cellulaire est un événement limitante dans la cicatrisation des plaies, et étudie les facteurs qui peuvent affecter la migration cellulaire contribuera à des thérapies de cibles pour améliorer la cicatrisation des plaies.
Ici, un test expérimental hautement reproductible repose sur des inserts de culture de silicone spécial pour évaluer la migration de cellules in vitro. Il repose sur la création d’un espace de μm (Pseudo-plaie) 500 sur une monocouche de cellules confluentes. Les cellules à la lisière du champ « blessé » artificielle vont commencer la migration vers la zone acellulaire, formant de nouveaux contacts de cellules. L’insert de la culture représente un nouvel outil pour les expériences de cicatrisation rapide. Deux réservoirs séparés par un mur de μm 500 sont fournis, et ils peuvent être placés correctement dans une assiette plat de 3 cm ou dans le puits d’une plaque de 12 puits. Remplir chaque compartiment de l’insert avec une suspension de cellules, permet aux cellules de se développer dans chaque zone désignée jusqu’au confluent, tandis que la suppression de l’insert engendrera un espace propre acellulaire d’environ 500 μm (la même largeur que le mur de séparation). Un milieu de culture cellulaire appropriée additionné d’un composé peut ensuite être ajouté dans le plat plaque/puits. Par la suite, les écarts peuvent être visualisées sous un microscope inversé, de préférence un équipé d’une caméra vidéo pour l’acquisition d’images à des intervalles de temps différents. Enfin, la mesure des changements dans la zone cellule couverte par le programme d’analyse des images automatisé sur Internet permettra la quantification de la vitesse de plaie fermeture et la migration cellulaire. Dans l’ensemble, cette méthode constitue une avancée en ce qui concerne le dosage classique, où une égratignure est faite manuellement par incision monocouches de cellules confluentes avec une aiguille stérile ou une pipette Astuce11. En effet, la dernière procédure peut détruire le fond en plastique du plat plaque/puits et le revêtement de surface, créant des rides. En outre, la zone « blessée » n’a pas une largeur bien définie sur toute la longueur de l’écart, car cela dépend fortement de la pression exercée par les chercheurs à la pointe de l’aiguille /. En outre, les délogent les cellules peuvent former des amas de cellules mortes et vivantes sur les bords de la rayure ; en outre, la diffusion des cellules vivantes dans la zone « blessé » peut interférer avec la vitesse de la migration cellulaire, générant des résultats non reproductibles,12.
En outre, grâce à une plateforme d’analyse image gratter, utilisateurs peuvent rapidement recevoir (en minutes) des données quantitatives sur le comportement migratoire des cellules sélectionnées sans la nécessité d’acquérir des logiciels supplémentaires. Cette plate-forme est capable d’analyser les images de microscopie de contraste de phase de faible (~ 5 X), moyen (~ 10 X) et grossissement élevé (~ 20 X). Après avoir téléchargé un fichier zip d’images (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format), l’analyse est automatiquement effectuée pour générer un fichier de synthèse qui montre le pourcentage de zones couvertes de cellule et de gratter les zones, ainsi que la vitesse de la cellule migration, à intervalles de temps distincts.
Dans ce travail, à l’aide d’un peau de grenouille AMP-dérivé, c’est-à-dire Esc(1-21) et son diastéréoisomère Esc(1-21) – 1C13et une lignée de cellules bronchiques exprimant la fonctionnelle CF transmembrane conductance regulator (CFTR)14,15, un exemple de migration cellulaire induite par le peptide en comparaison avec des échantillons (témoin) est fourni. Notez que l’épithélium des voies aériennes et CFTR jouent un rôle crucial dans le maintien de la fonction pulmonaire et plaie réparation16. En outre, au moyen d’inhibiteurs sélectifs (p. ex., AG1478)17 du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), preuve que la migration des cellules bronchiques induite par les peptides susmentionnées implique l’activation de l’EGFR12, 18 est signalée.
En résumé, l’objectif de cette procédure est de montrer comment l’utilisation de ces inserts de culture de silicone représente un test rapide et facile d’accès pour déterminer avec exactitude la migration des cellules adhérentes (par exemple, les cellules épithéliales bronchiques) et moléculaire mécanismes qui contrôlent ces événements.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migration cellulaire est un processus essentiel à de nombreuses manifestations physiologiques et pathologiques, y compris la guérison des plaies, le développement embryonnaire et métastases cancéreuses. La procédure de base pour étudier la migration cellulaire in vitro comprend : (i) la création d’une monocouche de cellules, (ii) la production d’une Pseudo-plaie dans la couche confluente de cellules, (iii) la capture d’images à différents intervalles de temps jusqu’à ce que la plaie de sutur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l’Université la Sapienza de Rome et la Fondation de recherche mucoviscidose italienne (projet FFC #11/2014 adopté par les délégations de la FFC de Pavie, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny et la sienne). Partie de ce travail a également été défendue par FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Nous sommes reconnaissants à m. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italie) pour fournir les cellules épithéliales bronchiques.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
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