Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.
Reporter-Enzym-Fluoreszenz (REF) nutzt Substrate, die spezifisch für Enzyme zur Bildgebung oder Aufdeckung von Fluoreszenz und Biolumineszenz in Zielorganismen von Interesse sind. Wir nutzen BlaC, ein Enzym, das konstitutiv durch alle M. Tuberkulose -Stämme ausgedrückt. REF ermöglicht schnelle Quantifizierung von Bakterien in der Lunge von infizierten Mäusen. Die gleiche Gruppe von Mäusen kann abgebildet werden, zu vielen Zeitpunkten, erheblich Kosten reduzieren, Auflisten von Bakterien schneller ermöglicht neuartige Beobachtungen in Wirt-Pathogen Interaktionen und statistische Aussagekraft zu erhöhen, da mehr Tiere pro Gruppe leicht gepflegt werden . REF ist extrem katalytische aufgrund der BlaC enzymatische Reporter sensitiver und spezifischer aufgrund der benutzerdefinierten Flourescence Resonanz Energietransfer (FRET) oder Fluorogenic Substrate verwendet. REF erfordert keine rekombinante Stämme, normale Wirt-Pathogen Interaktionen zu gewährleisten. Wir beschreiben die Bildgebung von M. Tuberkulose -Infektion mit einem Bund Substrat mit maximalen Emission bei 800 nm. Die Wellenlänge des Substrates ermöglicht empfindliche Tiefengewebe-Bildgebung bei Säugetieren. Wir skizzieren Aerosol-Infektion von Mäusen mit M. Tuberculosis, Anästhesie von Mäusen, Verwaltung der REF Substrat und optische Bildgebung. Diese Methode wird erfolgreich angewendet, zur Bewertung von Wirt-Pathogen Interaktionen und Wirksamkeit der Antibiotika gezielt M. Tuberculosis.
Die langsame Wachstumsrate von M. Tuberculosis ist ein Haupthindernis in schnelle Diagnose von Tuberkulose1,2,3. Während Kultur Diagnose dauert es Wochen basierte, Ergebnisse zu erzielen, hat säurefeste Abstrich diagnostische Einschränkungen4 Kinder5 und Patienten mit humanen Immundefizienz-Virus6,7. Optical imaging-Technologien wurden kürzlich als Alternative zu herkömmlichen Diagnoseverfahren für Tuberkulose8,9anerkannt. Fluoreszenz und Biolumineszenz können verwendet werden, um optisch M. Tuberculosis mit lebenden Tieren in Echtzeit-10,11,12,13,14Bild, 15,16,17,18,19. Optische Verfahren hat den Vorteil einer schnellen und spezifischen Beurteilung einer Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis20,21,22.
Wir skizzieren Details für optische Bildgebung von M. Tuberculosis in live Mäuse mit REF. Diese Methode ist sehr spezifisch und sensitiv23,24 , und ähnlich wie bei anderen optischen Methoden ist weniger teuer als andere Methoden der Tuberkulose (TB) imaging25, einschließlich Computertomographie (CT)26, magnetische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)27und F-FDG-Positronen-Emissions-Tomographie/CT (F-FDG-PET/CT)28. REF nutzt benutzerdefinierte fluoreszierende oder biolumineszenten Substrate, die bei der Spaltung durch eine bakterielle Enzym eine fluoreszierende Produkt8,29zu produzieren. Daher hat es den Vorteil, dass eine rekombinante mykobakteriellen Reporter Belastung30,31. Der Bund Substrat beschrieben besteht aus einem Fluorochrom und einen Durstlöscher, verbunden durch ein β-Lactam-Ring, der durch BlaC (β-Lactamase), natürlich konstitutiv durch Tuberkulose-Komplex Mycobacterium8, ausgedrückt hydrolysiert 32. die Bakterien erzeugen direkt Signal durch REF katalytische Aktivität, die Verstärkung von vielen Größenordnungen und empfindliche Detektion von M. Tuberculosisermöglicht.
In dieser Studie verwendeten REF-Substrat hat ausgezeichnete Gewebe eindringen in lebenden Tieren und Hintergrund aufgrund seiner langen Wellenlänge reduziert. Mit dieses langwellige Substrat ist es möglich, einen Schwellenwert von Erkennung für M. Tuberculosis von fast 100 zu erreichen Koloniebildenden Einheiten (KBE) in Vitro und < 1000 KBE in den Lungen von Mäusen in Vivo (ganze Tier)8, 33. REF kann als ein Diagnosetool für Auswurf, klinischen Materials und sogar direkt bei Patienten mit Mikro endoskopische Systeme16,32,33,34 aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität verwendet werden. REF kann auf jede klinische Belastung von Tuberkulose angewendet werden, weil es ein natürlich produzierten bakterielle Enzym, BlaC, für die Erkennung in allen Sorten vorhanden verwendet. Diese Eigenschaften machen REF imaging ein wertvolles Werkzeug in der präklinischen Tuberkuloseforschung im allgemeinen therapeutischen Erleichterung sowie Impfstoff Auswertung und Analyse der Pathogenese, aber letztlich auch zur Diagnose Tuberkulose angewandt werden Patienten.
Bei der Verwendung von bildgebender Verfahren, wie z. B. REF, gibt es Schlüsselstrategien, die Generierung von stabilen und konsistenten Daten zu ermöglichen. Optische Verfahren erzeugt Streulicht im Gewebe, die die Tiefe der Penetration, auswirken können, da es schwierig ist, in alle Richtungen emittierte Licht einzufangen. Verwendung von einem in der Nähe von Infrarot-Fluorophor (NIR) Substrat für REF Bildgebung mit einer Anregung und Emission Wellenlänge in der Querange von 700-900 nm ermöglicht minimale Absorption das Fluoreszenzsignal durch Säugetier-Gewebe. Die benutzerdefinierten gestaltete Substrat wurde durch die Verknüpfung einer NIR Fluorophor, IRDye 800Cw einen Quencher gebaut IRDye QC-1, von einem Lactam-Ring ermöglicht Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte abschrecken. IRDye hat ausgezeichnete Gewebe eindringen und Licht Streuung Eigenschaften und hat keinen keine offensichtlich schädliche Wirkung auf Säugetiere36, aus dem Blut und Organe durch 24 h. Fluoreszenz ausgeglichen signalisieren deutlich erhöht, ab 4 h nach Substrat-Verwaltung erreichen maximale Ebenen 6 h nach Verabreichung.
Die bakterielle infektiöse Dosis, die Art der Verwaltung von infektiöse Dosis und das Substrat sowie Zeitpunkte der imaging-Post-Infektion durch Pilotstudien durchführen sollten standardisiert werden, vor dem Einschiffen auf großen, komplexen, Experimente. Pilotstudien können erheblich reduzieren, Zeit und Kosten, wenn eine große Anzahl von Tieren imaging, weil ein Standardverfahren vor dem Ausführen der wichtigsten Experiment optimiert werden kann. Bakterielle Belastungen sollte ermittelt werden, in den Organen/Geweben von Interesse nach Ganzkörper-Bildgebung mit Trans-Beleuchtung und ex Vivo Lunge Bildgebung mit Epi-Beleuchtung um die Quelle des Signals zu überprüfen und bestimmen die Qualität der Korrelation mit bakteriellen Zahlen vorhanden8. Pilot-Studien bieten einen Einblick in die Schwelle der Erkennung, dynamischen Bereich der Technik sowie die Bestimmung der optimalen Versuchsbedingungen für die Bildgebung.
Die Hauptvorteile der Verwendung von REF Bildgebung im Vergleich zu anderen fluoreszenten und biolumineszenten Strategien sind seine hohe Sensibilität und die Fähigkeit zur natürlichen M. Tuberculosis Bild Stämme. REF imaging nutzt das katalytisch robuste Enzym BlaC, die in allen klinischen Isolaten von M. Tuberculosis und Tuberkulose-Komplex Stämme konserviert ist. Die große Empfindlichkeit des REF imaging ist aufgrund der raschen katalytische Rate von BlaC in Kombination mit Eigentumsvorbehalt gespalten fluoreszierende Produkts durch die Wirtszelle. Signalisieren Sie kontinuierlich erhöht, solange das Substrat zur Verfügung, wodurch nahezu unbegrenzte Aufbau des Signals innerhalb der infizierten Zellen und Gewebe ist. Diese erhöhte Empfindlichkeit des REF Bildgebung im Vergleich zu alternativen Ansätzen der Bildgebung ermöglicht spezifische Erkennung von M. Tuberculosis sowohl in Vitro und in Vivo8,23,24, 29.
REF imaging einsetzbar für bakterielle Erkennung ohne gentechnische Veränderungen ermöglichen die direkte Anwendung Infektionsmodell, entweder Labor Tiere8,37 oder menschlichen klinischen Materials29,38 . REF kann verwendet werden, zu erkennen und eine Vielzahl von Krankheitserregern39,40, Bild, da Fluorogenic Substrate für zahlreiche enzymatische Ziele außer BlaC wie Proteasen, Kinasen, Ureases und β-Galactosidases entwickelt werden können. Zeigt jedoch vorsichtig sein, dass das Ziel nachgedacht werden sollte um sicherzustellen es optimale Eigenschaften für die Bildgebung. BlaC stellt ein gutes Modell Enzym für Merkmale, die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie sicherstellt. REF imaging bietet eine sofortige auslesen auf bakterielle Last in Lunge bei Infektionen, die stark Fortschritte beschleunigt im Studium der Tuberkulose Pathogenese, da die Bestimmung der bakteriellen Zahlen erfordert in der Regel drei bis sechs Wochen, aber auch in mehr schnellsten wachsenden Organismen, die diese Vorgehensweise sehr viel spart Zeit. REF kann auch verwendet werden, Karzinome an Tuberkulose, ein zentrales Problem bei der Diagnose von nodulären Läsionen in Patienten41,42zu unterscheiden. “REF” dient als neuartige Werkzeug, translationale Tuberkulose Bildgebung zu beschleunigen und kann auch für den Menschen potenziell ermöglicht schnellen Vorhersage von therapeutischen Ergebnissen angewendet werden.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
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Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |