Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер
Summary
Мы описываем оптических изображений мышей, инфицированных микобактериями туберкулеза (микобактерий туберкулеза) с помощью репортер фермента флуоресцирования (REF). Этот протокол облегчает чувствительных и конкретных обнаружение микобактерий туберкулеза в доклинических животных моделей для исследования патогенеза, клинической медицины и вакцины.
Abstract
Репортер фермента флуоресцирования (REF) использует подложках, которые являются специфическими для ферменты, присутствующие в целевой организмов, представляющих интерес для изображений или обнаружения флуоресценции или биолюминесценции. Мы используем BlaC, фермент, конститутивно выраженные всех штаммов микобактерий туберкулеза . REF позволяет быстро квантификации бактерий в легких зараженных мышей. Той же группе мышей может отражаться во многих точках времени, значительно сократить расходы, перечисление бактерий более быстро, позволяя Роман наблюдений в хост патогенный взаимодействиях и повышение статистической мощности, так как легко поддерживаются более животных для каждой группы . ССЫЛКА является чрезвычайно чувствительных благодаря каталитического характера BlaC ферментативные репортер и конкретных пользовательских flourescence резонанс передачи энергии (ЛАДА) или fluorogenic субстратов используется. REF не требуют рекомбинантных штаммов, обеспечивая нормальный хост возбудитель взаимодействий. Мы описываем изображений микобактерий инфекции с помощью подложке ладу с максимальной выбросов на 800 Нм. Длина волны субстрата позволяет изображение чувствительные глубоких тканей млекопитающих. Мы очертим аэрозоля заражение мышей с микобактерий туберкулеза, анестезия мышей, администрация REF субстрат и оптических изображений. Этот метод успешно применяется для оценки взаимодействия хост возбудителя и эффективность антибиотиков, ориентация микобактерий туберкулеза.
Introduction
Медленный темп роста микобактерий туберкулеза является основным камнем преткновения в быстрой диагностики туберкулеза1,2,3. В то время как культуре на основе диагностики занимает недели для получения результатов, Фита мазок имеет диагностических ограничения4 в5 детей и пациентов, совместно инфицированных вирусом иммунодефицита человека6,7. Оптические технологии визуализации недавно были признаны альтернативой традиционных методов диагностики туберкулеза8,9. Флуоресценции и биолюминесценции может использоваться для оптически изображение микобактерий туберкулеза в живых животных в реальном времени10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19. Оптическая томография имеет преимущество быстрого и конкретные оценки инфекции с микобактерий туберкулезав20,21,22.
Мы приводим детали для оптических изображений в живых мышей, использование REF микобактерий туберкулеза. Этот метод является весьма конкретные и чувствительных в23,24 и, похож на другие оптические методы, менее дорогостоящим, чем другие методы туберкулеза (ТБ) imaging25, включая компьютерная томография (КТ)26, магнитные резонанс, изображений (MRI)27и позитронно эмиссионная томография/CT (F-ФДГ-ПЭТ/КТ) F-fluorodeoxyglucose28. REF использует пользовательские флуоресцентные или биолюминесцентных подложках, которые после расщепления от бактериальный фермент, производят флуоресцентный продукта8,29. Таким образом он имеет преимущество, не требующих рекомбинантных микобактериальной репортер штамм30,31. Субстрат ладу описал состоит из флюрохром и утоления соединены β-лактамные кольцо, которое является гидролизованный BlaC (β-лактамаз), естественно, конститутивно выраженные микобактериитуберкулеза комплекс в8, 32. бактерии непосредственно генерации сигнала благодаря REF каталитической активности, который позволяет усиления на много порядков и чувствительных обнаружение микобактерийтуберкулеза.
Субстрат REF, используемые в данном исследовании имеет отличные ткани проникновения в живых животных и снижение фона из-за своей длиной волны. С этот субстрат длинноволновых это можно достичь порога обнаружения для микобактерий туберкулеза почти 100 колонии, образуя единиц (CFU) в пробирке и < 1000 кое в легких мышей в vivo (все животное)8, 33. REF может использоваться как средство диагностики для мокроты, клинического материала и даже непосредственно у больных с микро эндоскопических систем16,32,,3334 из-за его высокой чувствительностью и специфичностью. REF может применяться к любой клинической штамм туберкулеза, потому что он использует естественно произведенные бактериальный фермент, BlaC, для обнаружения в всех штаммов. Эти характеристики делают REF imaging ценным инструментом исследования доклинические туберкулеза в целом для облегчения терапевтических и оценки вакцин, а также анализ патогенеза, но также в конечном итоге могут быть применены к диагностике туберкулеза пациентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
При использовании методы обработки изображений, например REF, есть ключевые стратегии, которые позволяют создание надежных и последовательных данных. Оптическая томография производит рассеянного света в тканях, которые могут повлиять на глубину проникновения, поскольку трудно захватить света, излучаемого во всех направлениях. Использование вблизи инфра красный Флюорофор (NIR) субстрат для изображений, имеющих длину волны возбуждения и выбросов в Querange 700-900 нм REF способствует минимальным поглощением флуоресцентного сигнала тканей млекопитающих. Пользовательские разработан субстрат был построен путем увязывания NIR Флюорофор, IRDye 800Cw для утоления IRDye QC-1, лактамные кольцо, позволяя на основе передачи тушения флуоресценции резонанс энергии. IRDye имеет отличные ткани проникновение света рассеяния характеристик и не имеют каких-либо очевидной вредное воздействие на млекопитающих36, очищали от крови и органов 24 h. флуоресценции сигнала значительно увеличивается, начиная с 4 ч после Субстрат администрации, достигнув максимальной уровнях 6 ч после приема.
Прежде чем приступать на больших, сложных, эксперименты должны быть стандартизированы бактериальных инфекционных дозы, режим администрации инфекционных дозы и субстрата, а также время точек изображений пост инфекции путем проведения экспериментальных исследований. Экспериментальные исследования может значительно сократить время и затраты при визуализации большое количество животных, потому что стандартная процедура может быть оптимизирована до делать ключевые эксперимент. Бактериальной нагрузки должны определяться в органы/тканях интерес после всего тела изображений с помощью транс освещение и ex vivo томографии легких с помощью epi освещение для проверки источника сигнала и определить качество корреляции с бактериальной числа нынешних8. Экспериментальные исследования даст понимание порог обнаружения, динамический диапазон техники, а также определение оптимальной экспериментальных условий для изображений.
Основными преимуществами использования изображений как REF по сравнению с другими флуоресцентные и биолюминесцентных стратегии являются его высокая чувствительность и способность изображения природных микобактерий туберкулеза штаммов. Ссылка изображений использует каталитически надежные фермента BlaC, которая сохраняется во всех клинических изолятов микобактерий туберкулеза и туберкулеза комплекс штаммов. Большая чувствительность REF изображений объясняется быстрое катализатора скорость BlaC в сочетании с сохранением рассеченного флуоресцентные продукта клетки-хозяина. Сигнал непрерывно увеличивается до тех пор, как субстрат доступен, что приводит к практически неограниченную накопления сигнала внутри инфицированных клеток и тканей. Это повышенная чувствительность REF изображений по сравнению с альтернативных подходов изображений позволяет конкретного выявления микобактерий туберкулеза оба в пробирке и в vivo8,23,24, 29.
Ссылка изображений может использоваться для обнаружения в бактериальные без генетических изменений, позволяя его непосредственное применение к любому инфекция модели, либо лабораторных животных8,37 или клинических материалов человека29,38 . REF может использоваться для обнаружения и изображения широкий спектр патогенов39,40, так как fluorogenic субстратов могут быть разработаны для многочисленных ферментативные целей помимо BlaC такие протеаз, киназы, ureases и β-galactosidases. Однако осторожны, следует подумать с целью обеспечения он выводит оптимальные характеристики для воображения. BlaC представляет собой хорошую модель фермент для характеристик, которые обеспечат успешное применение этой стратегии. Ссылка изображений обеспечивает немедленное считывание на бактериальной нагрузки в легких во время инфекции, которая значительно ускоряет прогресс в изучении патогенеза туберкулеза, поскольку определение бактериальной чисел обычно требует трех-шести недель, но даже в более быстро растущих организмов, такой подход позволит сэкономить немало времени. ССЫЛКА может также использоваться для дискриминации карциномы от туберкулеза, ключевой проблемой в диагноз узловой поражений в больных41,42. REF служит роман инструментом для ускорения трансляционная туберкулезом изображений и может применяться даже для людей, потенциально позволяя быстрое предсказание терапевтических результатов.
Materials
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| CNIR800 | Custom synthesized | ||
| Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
| OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
| Sporcidin | RE-1284F | ||
| 7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
| Madison Chamber | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
| Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
| Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
| M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
| Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |
References
- Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
- Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
- Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
- Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
- Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
- Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
- Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
- Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
- Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
- Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
- Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
- Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
- Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
- Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
- Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
- Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
- Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
- Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
- Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
- Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
- Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
- Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
- Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
- Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
- Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
- Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
- Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
- Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
- Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
- Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
- Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , (2015).
- Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
- Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
- Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
- Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).
