Summary

Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery

Published: December 12, 2017
doi:

Summary

Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.

Abstract

High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.

Introduction

Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção4.

O desenvolvimento de um ensaio sorológico específico de ZIKV é um desafio por duas razões: primeiro, os antígenos Zika que o sistema imunológico humano responde não são atualmente conhecidos; e sequências de aminoácidos conservados, segundo flavivírus induzem reactividade cruzada do anticorpo. Nosso objetivo era descobrir exclusivos peptídeos ZIKV específicos para ser usado no diagnóstico. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para bibliotecas de peptídeo de tela cobrindo toda proteínas incluindo fago, bacteriano, e superfície de levedura exibir5,6,7,8,9, 10. Nossa estratégia foi usar um microarray de peptídeo de alta densidade que permite rápida e barata elevado-throughput exames serológicos11,12 e posteriormente os peptídeos identificados podem ser usados para melhorar a corrente serológico ensaios para detecção da infecção por ZIKV.

Este protocolo permite a descoberta de Zika vírus específico diagnósticos peptídeos usando um microarray de peptídeo de alta densidade (Figura 1). O peptídeo high-density microarray foi produzido usando a tecnologia de impressão laser do peptide. A sequência de proteína inteira ZIKV constituído por resíduos de aminoácidos 3.423 baseia a estirpe da Polinésia francesa (GenBank: KJ776791.2), foi impresso em um slide de vidro padrão em blocos de 15 resíduos lineares com uma sobreposição de 14 resíduos de aminoácidos em duplicado para um total de 6.846 pontos de peptídeo. Além dos peptídeos de sequência de proteínas Zika todo, o microarray utiliza hemaglutinina gripe (HA) de peptídeos para controles internos.

Uma Zika validado positivos Obtida de Wadsworth Center (Albany, NY), de amostra de soro foi usada para identificar específicas imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) reativos peptídeos. Após a incubação com a amostra durante a noite, o microarray foi manchada com um anticorpo conjugado fluorocromo secundário (anti-humano IgM ou IgG anti-humano) e analisado em um scanner de microarray. Quantificação de intensidades local e anotação de peptídeo foi realizada com um software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray.

Protocol

Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY. 1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptíde…

Representative Results

Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amos…

Discussion

Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.

Materials

PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

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Cite This Article
Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

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