Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery
Summary
In questo protocollo, descriviamo una tecnica per scoprire Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide. Questo protocollo può essere idoneamente adattato per altre malattie infettive emergenti.
Abstract
Microarrays ad alta densità del peptide consentire lo screening dei peptidi più di seimila in una diapositiva di microscopia singola standard. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci, identificazione del target terapeutico e lo sviluppo della diagnostica. Qui, presentiamo un protocollo per scoprire peptidi diagnostici specifici di virus (ZIKV) Zika usando un microarray ad alta densità del peptide. Un campione di siero umano convalidato per infezione ZIKV è stato incubato con un microarray ad alta densità del peptide contenente l’intera proteina ZIKV tradotta in 3.423 unico 15 lineare dell’aminoacido (aa) residui con una sovrapposizione di 14-aa residuo stampato in duplice copia. Colorazione con anticorpi secondari diversi all’interno della matrice stessa, abbiamo rilevato peptidi che legano alla immunoglobulina M (IgM) e gli anticorpi dell’immunoglobulina G (IgG) sono presenti nel siero. Questi peptidi sono stati selezionati per ulteriori esperimenti di convalida. In questo protocollo, descriviamo la strategia seguita per progettare, elaborare e analizzare un microarray ad alta densità del peptide.
Introduction
Zika diagnosi del virus (ZIKV) basata sui sintomi clinici è impegnativo, perché condivide con Dengue e Chikungunya virus infezione1vettori, distribuzione geografica e sintomi. Dato il rischio di esiti avversi della gravidanza in donne infettate con ZIKV durante la gravidanza, è importante distinguere tra i 3 virus. Anche se l’attuale test diagnostici molecolari sono specifici, sono solo utili nel sangue o saliva durante il periodo relativamente breve di infezione acuta2,3. I test sierologici sono essenziali per la diagnosi fuori di questo periodo iniziale di infezione4.
Lo sviluppo di un’analisi sierologica specifica ZIKV è difficile per due motivi: in primo luogo, gli antigeni di Zika che il sistema immunitario umano risponde a non sono attualmente noti; e flavivirus conservato, secondo sequenze aminoacidiche inducono cross-reattività dell’anticorpo. Il nostro obiettivo era di scoprire unici peptidi specifici ZIKV per essere utilizzato nella diagnostica. Diversi approcci sono stati sviluppati per librerie peptidiche schermo che copre intere proteine compreso Fago, batterica, e superficie di lievito visualizzare5,6,7,8,9, 10. La nostra strategia era di usare un microarray di peptide ad alta densità che consente il rapido e poco costoso high throughput screening sierologici11,12 e successivamente i peptidi identificati possono essere utilizzati per migliorare la corrente sierologici analisi per la rilevazione dell’infezione ZIKV.
Questo protocollo consente l’individuazione di Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide (Figura 1). Il microarray ad alta densità del peptide è stato prodotto utilizzando la tecnologia di stampa laser del peptide. L’intera sequenza di proteine ZIKV che consiste di 3.423 residui dell’amminoacido basato sul ceppo polinesiano francese (GenBank: KJ776791.2), è stato stampato su un vetrino standard in blocchi di 15 residui lineare con una sovrapposizione di 14 residui dell’amminoacido in duplicato per un totale di 6.846 macchie di peptide. Oltre i peptidi di sequenza di proteine Zika intero, il microarray utilizza emoagglutinina influenzale peptidi (HA) per i controlli interni.
Un Zika convalidato positivo campione di siero ottenuto da Wadsworth Center (Albany, NY), è stato utilizzato per identificare specifici dell’immunoglobulina M (IgM) e peptidi reattive dell’immunoglobulina G (IgG). Dopo incubazione con il campione durante la notte, il microarray è stato macchiato con un anticorpo coniugato secondario fluorocromo (IgM anti-umano o anti-IgG umane) e analizzato su uno scanner di microarray. Quantificazione di intensità di spot e annotazione del peptide è stata effettuata con un software specifico fornito dalla stessa società che ha prodotto il microarray.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo progettato un protocollo che utilizza un microarray ad alta densità del peptide contenente l’intera sequenza di proteina di Zika virus (ceppo polinesiano francese). Il microarray è stato fabbricato da peptidi lineari sovrapposti differenti 3.423 stampa. Ogni peptide era 15 aminoacidi e varia da un solo residuo dal suo vicino più prossimo nella sequenza (cioè, sovrapposizione di 14 residui). Anche se più breve sovrapposizioni possono essere stampati, mapping di epitopo è più preciso con più sovrap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il supporto corrente è fornito da una sovvenzione di supplemento amministrativo SBIR (Small Business Innovation Research) da NIDCRR44 DE024456. Concessione di NIDCR HIV che l’evoluzione di NIDCR concedere U01 DE017855 per lo sviluppo di una conferma diagnostica point-of-care per l’HIV. Noi riconosciamo con gratitudine Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) per la sua assistenza tecnica e supporto. Ringraziamo anche NYU Langone Medical Center per la LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
References
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
