Utilizzando l'analisi filogenetica di indagare l'origine genica negli eucarioti

Sequenze di DNA o RNA trasportano informazioni genetiche per i fenotipi sottostanti che può essere analizzato attraverso metodi fisiologici e biochimici o osservato attraverso prove morfologiche e fossili. In un certo senso, è più affidabile di valutazione esterni fenotipi perché il primo è la base per quest’ultima informazione genetica. In studio evolutivo, prova fossile è molto diretta e convincente. Tuttavia, molti organismi, quali microrganismi, hanno poche possibilità di formare un fossile durante Età geologiche lungo. Pertanto, informazioni molecolari quali sequenze nucleotidiche e sequenze dell’amminoacido da organismi esistenti correlati sono di valore per esplorare relazioni evolutive¹. Nello studio presente, è stata fornita una semplice introduzione di conoscenza di base filogenetica protocollo facile da imparare per i nuovi arrivati che hanno bisogno di costruire un albero filogenetico in proprio.

Sia DNA (nucleotidi) e sequenze di proteine (aminoacidi) possono essere utilizzati per dedurre le relazioni filogenetiche tra geni omologhi, organelli o anche organismi². Sequenze di DNA sono maggiori probabile di essere colpiti dai cambiamenti nel corso dell’evoluzione. Al contrario, sequenze dell’amminoacido sono molto più stabili, dato che sinonima mutazioni nelle sequenze nucleotidiche non causano mutazioni nelle sequenze dell’amminoacido. Di conseguenza, sequenze di DNA sono utili per il confronto di geni omologhi da organismi strettamente correlati, mentre sequenze dell’amminoacido sono appropriati per geni omologhi da organismi lontanamente correlati³.

Un’analisi filogenetica inizia con l’allineamento dell’amminoacido o nucleotide sequenze⁴ Estratto da un genoma con annotazioni sequenziamento database⁵ elencati in formato FASTA, vale a dire, proteina espressa o presunta sequenze, sequenze di RNA , o sequenze di DNA. Vale la pena notare che è fondamentale per raccogliere sequenze di alta qualità per l’analisi, e sequenze omologhe solo possono essere utilizzati per analizzare le relazioni filogenetiche. Molte piattaforme diverse come Clustal W, Clustal X, muscolo, T-caffè, MAFFT, può essere utilizzato per l’allineamento di sequenza. Il più ampiamente usato è Clustal Omega^6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), che può essere utilizzato online o può essere scaricato gratuitamente gratuitamente. Lo strumento di allineamento ha molti parametri che l’utente può regolare prima di iniziare l’allineamento, ma i parametri di default funzionano bene nella maggior parte dei casi. Dopo il processo è completo, le sequenze allineate devono essere salvate nel formato corretto per il passaggio successivo. Essi devono quindi essere modificati o tagliati utilizzando un software di editing, come ad esempio BioEdit, perché la costruzione di alberi filogenetici da MEGA richiede le sequenze per essere di uguale lunghezza (inclusi sia dell’amminoacido abbreviazioni e trattini. Nella sequenza allineata, qualsiasi posizione senza un amminoacido o nucleotide è rappresentato da un trattino “-“). In generale, tutte le sporgenti aminoacidi o nucleotidi alle due estremità dell’allineamento dovrebbe essere rimosso. Inoltre, le colonne che contengono le sequenze scarsamente allineate nell’allineamento possono essere eliminate perché trasmettere poche preziose informazioni e a volte può dare confusione o false informazioni³. Le colonne contenenti uno o più trattini possono essere eliminate in questo momento o nella successiva fase di costruzione di albero. In alternativa, sono utilizzabili per il calcolo filogenetica. Al termine della sequenza di allineamento e di rifilatura, le sequenze allineate devono essere salvate in formato FASTA, o il formato desiderato, per un uso successivo.

Molte piattaforme di software forniscono funzioni di costruzione albero utilizzando diversi metodi o algoritmi. In generale, i metodi possono essere classificati come metodi di matrice di distanza o metodi di dati discreti. Metodi di matrice di distanza sono semplici e veloci per calcolare, mentre i metodi di dati discreti sono complicati e che richiede tempo. Per taxa strettamente correlate con un alto grado di condivisione dell’identità di sequenza dell’amminoacido o nucleotide, un metodo di matrice di distanza (Neighbor unendo: NJ; Metodo di gruppo coppia non ponderata con media aritmetica: UPGMA) è appropriato; lontanamente correlate taxa, un metodo di dati discreti (metodo della massima verosimiglianza: ML; Massima parsimonia: MP; Inferenza bayesiana) è ottimale^3,8. In questo studio, i metodi di ML in MEGA (6.0.6) e inferenza bayesiana (MrBayes 3.2) sono stati applicati per costruire alberi filogenetici⁹. Idealmente, quando vengono utilizzati i parametri e il modello adeguato, i risultati derivati da diversi metodi possono essere coerenti, e sono dunque più affidabile e convincente.

Per un albero filogenetico di ML costruito utilizzando MEGA¹⁰, il file di sequenza allineata in formato FASTA deve essere caricato nel programma. Il primo passo è quindi di selezionare il modello di sostituzione ottimale per i dati caricati. Tutti i modelli di sostituzione disponibili vengono confrontati in base sulle sequenze caricate, e loro punteggi finali verranno mostrati in una tabella di risultati. Selezionare il modello con il Punteggio di criterio BIC (Bayesian Information) più piccolo (elencato per primo nella tabella), impostare i parametri di ML secondo il modello raccomandato e avviare il calcolo. Il tempo di calcolo varia da alcuni minuti a diversi giorni, a seconda della complessità dei dati caricati (lunghezza delle sequenze e numero di taxa) e le prestazioni del computer su cui vengono eseguiti i programmi. Quando il calcolo è finito, un albero filogenetico appare in una nuova finestra. Salvare il file come “FileName.mat”. Dopo aver impostato i parametri per specificare l’aspetto dell’albero, salvare ancora una volta. Utilizzando questo metodo, MEGA è in grado di generare figure di pubblicazione grado albero filogenetico.

Per la costruzione di albero con MrBayes¹¹, il primo passo è quello di trasformare la sequenza allineata, che di solito è elencata in formato FASTA, in formato nexus (NEX come tipo di file). Trasformazione di file FASTA in nexus formato possono essere elaborati in MEGA. Successivamente, la sequenza allineata nel nexus formato possa essere caricata in MrBayes. Quando il file viene caricato correttamente, è necessario specificare i parametri dettagliati per il calcolo dell’albero. Questi parametri includono dettagli come modello di sostituzione dell’amminoacido, tassi di variazione, numero catena-catena di Markov Monte Carlo (MCMC) accoppiamento, numero ngen, media deviazione standard delle frequenze di Spalato e così via. Dopo questi parametri sono stati specificati, è possibile avviare il calcolo. Alla fine, due figure di albero in ASC II codice, un visualizzando clade credibilità e le altre lunghezze del ramo visualizzando, verrà visualizzato sullo schermo.

Il risultato di albero verrà salvato automaticamente come “FileName.nex.con”. Questo file di albero può essere aperto e modificato da FigTree, e la cifra in FigTree può essere modificata ulteriormente per renderlo più adatto per la pubblicazione.

In questo studio, 228 proteine dolci, tra cui 35 dolci da eucarioti unicellulari e 57 SemiSWEETs da procarioti, sono stati analizzati come un esempio. I dolci e il SemiSWEETs sono stati caratterizzati come glucosio, fruttosio o saccarosio trasportatori attraverso membrane^12,13. L’analisi filogenetica suggerisce che i due domini MtN3/saliva contenente dolci potrebbero essere derivati da una fusione evolutiva di un passato batterica e di un archaeon¹⁴.