Mit der phylogenetischen Analyse zu eukaryotischen Gens Herkunft untersuchen
Summary
Eine Methode des Konstruierens einer phylogenetischen Stammbaum basierend auf Sequenzhomologie von Süßigkeiten von Eukaryoten und SemiSWEETs von Prokaryoten wird beschrieben. Phylogenetische Analyse ist ein nützliches Werkzeug für die Erklärung der evolutionären Verwandtschaft zwischen Homologen Proteine oder Gene aus verschiedenen Organismengruppen.
Abstract
Phylogenetische Analyse verwendet Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen oder andere Parameter, wie Domain-Sequenzen und dreidimensionale Struktur, um einen Baum um zu zeigen, die evolutionäre Beziehung zwischen den verschiedenen Taxa (Klassifizierung Einheiten) in der molekularen konstruieren Ebene. Phylogenetische Analyse kann auch zu untersuchen, Domänen-Verhältnisse innerhalb einer einzelnen Taxon verwendet werden, vor allem für Organismen, die erhebliche unterzogen wurden zu ändern, in der Morphologie und Physiologie, sondern für die Forscher fossile Beweise fehlen die Organismen langen evolutionären Geschichte oder Knappheit der Versteinerung.
In diesem Text wird ein detailliertes Protokoll beschrieben nach der phylogenetischen Methode, einschließlich der Aminosäure Sequenzalignment mit Clustal Omega und anschließende phylogenetischen Baum Bau verwenden beide maximale Wahrscheinlichkeit (ML) der molekularen Evolutionäre Genetik Analyse (MEGA) und Bayesian Inference über MrBayes. Um den Ursprung der eukaryotic Zucker wird schließlich Transporter exportiert werden (SÜß) Gene zu untersuchen, wurden 228 Süßigkeiten einschließlich 35 süße aus einzelligen Eukaryoten und 57 halbsüß Proteine von Prokaryoten analysiert. Interessanterweise fanden sich SemiSWEETs in Prokaryoten, aber Süßigkeiten fanden sich in den Eukaryotes. Zwei Stammbäumen mit theoretisch unterschiedliche Methoden konstruiert haben durchweg vorgeschlagen, dass das erste eukaryotische süße gen aus der Verschmelzung von einer bakteriellen halbsüß gen und eine Archaeen halbsüß gen stammen könnte. Es ist erwähnenswert, dass man eine phylogenetische Analyse nur anhand Schluss zu ziehen, obwohl es empfiehlt sich, erklären die grundlegende Beziehung zwischen verschiedenen Taxa, die schwierig oder sogar unmöglich zu erkennen, mit experimentellen Mitteln ist vorsichtig sein sollte .
Introduction
DNA- oder RNA-Sequenzen tragen genetischen Information für zugrunde liegende Phänotypen, die durch physiologische und biochemische Methoden analysiert oder durch morphologische und fossilen Beweise beobachtet werden kann. In gewisser Weise ist genetischer Information zuverlässiger als externe Phänotypen zu bewerten, da erstere die Grundlage für Letzteres ist. In evolutionären Studie ist Fossilien sehr direkt und überzeugend. Jedoch haben viele Organismen, wie z. B. Mikroorganismen, kaum eine Chance, ein Fossil in langen geologischen Zeitaltern zu bilden. Daher molekularer Informationen wie Nukleotidsequenzen und Aminosäure-Sequenzen von verwandten extant Organismen sind von Wert für die Erkundung evolutionären Beziehungen1. In der vorliegenden Studie lieferte eine einfache Einführung phylogenetische Grundkenntnisse und ein einfach zu erlernendes Protokoll für Neulinge, die einen phylogenetischen Stammbaum auf eigene Faust zu konstruieren müssen.
DNA (Nukleotide) und Proteinsequenzen (Aminosäure) können zur phylogenetische Beziehungen zwischen homologen Gene, Organellen oder sogar Organismen2ableiten. DNA-Sequenzen sind eher im Laufe der Evolution von Änderungen betroffen sein. Im Gegensatz dazu sind Aminosäure-Sequenzen wesentlich stabiler, da die Synonyme Mutationen im Nukleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen keine Mutationen verursachen. Dadurch eignen sich DNA-Sequenzen zum Vergleich homologer Gene von eng verwandten Organismen, während Aminosäuresequenzen für Homologe Gene von weitläufig verwandten Organismen3geeignet sind.
Eine phylogenetische Analyse beginnt mit der Ausrichtung der Aminosäure oder Nukleotid-Sequenzen4 abgerufen aus einer kommentierten Genom Sequenzierung Datenbank5 aufgeführt im FASTA-Format, d. h., vermeintliche oder exprimierten Protein-Sequenzen, RNA-Sequenzen , oder DNA-Sequenzen. Es ist erwähnenswert, dass es entscheidend für qualitativ hochwertige Sequenzen für die Analyse zu sammeln, und nur homologe Sequenzen können zur phylogenetische Beziehungen zu analysieren. Viele verschiedene Plattformen wie Clustal W, Clustal X, Muskel, T-Coffee, MAFFT, eignet sich für Sequenzalignment. Die am weitesten verbreitete Clustal Omega6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), die online verwendet werden oder kann kostenlos heruntergeladen werden ist kostenlos. Das Alignment-Tool hat viele Parameter, die der Benutzer kann vor dem Start der Ausrichtung anpassen, sondern die Standardparameter arbeiten in den meisten Fällen gut. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, sollte die ausgerichteten Sequenzen in das richtige Format für den nächsten Schritt gespeichert werden. Sie sollten dann bearbeitet werden oder getrimmt mit einem Bildbearbeitungs-Software, wie z. B. BioEdit, weil phylogenetischen Baum Bau von MEGA die Sequenzen erfordert von gleicher Länge (einschließlich Aminosäure Abkürzungen und Bindestriche. In der abgestimmten Reihenfolge jeder Position ohne eine Aminosäure oder ein Nukleotid ist vertreten durch einen Bindestrich “-“). Im Allgemeinen sollten alle hervorstehenden Aminosäuren oder Nukleotide an beiden Enden der Achse entfernt werden. Darüber hinaus können Spalten mit schlecht ausgerichtete Sequenzen in der Achse gelöscht werden, da sie wenig wertvolle Informationen zu vermitteln, und manchmal verwirrend oder falsche Informationen3geben können. Die Spalten, in denen ein oder mehrere Bindestriche können zu diesem Zeitpunkt oder in der späteren Bauphase Baum gelöscht werden. Alternativ können sie für die phylogenetische Berechnung verwendet werden. Wenn Sequenzalignment und Trimmen ist beendet, sollte die ausgerichteten Sequenzen im FASTA-Format oder das gewünschte Format für die spätere Verwendung gespeichert werden.
Viele Software-Plattformen bieten Baum Bau Funktionen mit unterschiedlichen Methoden und Algorithmen. Die Methoden können in der Regel als Distance Matrix-Methoden oder diskrete Datenmethoden klassifiziert werden. Distance Matrix-Methoden sind einfach und schnell zu berechnen, während diskrete Datenmethoden kompliziert und zeitaufwändig sind. Für sehr eng verwandten Taxa mit ein hohes Maß an Austausch der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz Identität, eine Distance Matrix-Methode (Nachbar Beitritt: NJ; Ungewichtete paar Gruppe Methode mit arithmetisches Mittel: UPGMA) ist angebracht; für weitläufig verwandten Taxa, eine diskrete Daten-Methode (Maximum Likelihood: ML; Maximale Sparsamkeit: MP; Bayesian Inference) ist optimale3,8. In dieser Studie wurden die ML-Methoden in MEGA (6.0.6) und Bayesian Inference (MrBayes 3.2) angewendet, um Stammbäumen9zu konstruieren. Ideal, wenn das richtige Modell und die Parameter verwendet werden, die Ergebnisse aus den unterschiedlichen Verfahren abgeleitet möglicherweise konsistent, und sie sind so zuverlässig und überzeugend.
Für ML phylogenetischen Baum mit MEGA10konstruiert muss die ausgerichteten Sequenz Datei im FASTA-Format in das Programm hochgeladen werden. Der erste Schritt ist dann der optimale Ersatz-Modell für die hochgeladenen Daten auswählen. Alle verfügbaren Ersatz-Modelle sind anhand der hochgeladenen Sequenzen verglichen, und ihre endgültige Ergebnisse in einer Ergebnistabelle angezeigt werden. Wählen Sie das Modell mit dem kleinsten Bayes-Kriterium (BIC)-Score (zuerst in der Tabelle aufgeführt), stellen Sie ML-Parameter nach dem empfohlenen Modell ein und starten Sie die Berechnung. Die Berechnungszeit hängt von einigen Minuten bis zu mehreren Tagen, abhängig von der Komplexität der geladenen Daten (Länge der Sequenzen und Anzahl der Taxa) und die Leistung des Computers, auf dem die Programme ausgeführt werden. Wenn die Berechnung beendet ist, wird ein phylogenetischer Baum in einem neuen Fenster angezeigt. Speichern Sie die Datei als “FileName.mat”. Nach dem Einstellen der Parameter für das Erscheinungsbild des Baumes festzulegen, einmal mehr sparen. Mit dieser Methode kann MEGA Publikation Grade phylogenetischen Stammbaum Zahlen generieren.
Für Baum Bau mit MrBayes11ist der erste Schritt zur Nexus-Format (.nex als Dateityp) ausgerichtete Sequenz, die in der Regel im FASTA-Format aufgeführt ist, verwandeln. Nexus-Format FASTA Dateien verwandeln kann in MEGA verarbeitet werden. Als nächstes kann die abgestimmte Sequenz im Nexus-Format in MrBayes hochgeladen werden. Wenn die Datei erfolgreich hochgeladen wurde, geben Sie detaillierte Parameter für die Berechnung der Baum. Diese Parameter umfassen Details wie Aminosäure-Substitution Modell, Variante Raten, Anzahl der Kette für Markov Chain Monte Carlo (MCMC) Kupplung, Ngen Anzahl, durchschnittliche Standardabweichung der geteilten Frequenzen und so weiter. Nachdem diese Parameter angegeben haben, starten Sie die Berechnung. Am Ende zwei Baum-Figuren im ASC II-Code, eine Vorführung Clade Glaubwürdigkeit und die andere zeigt Zweig Längen, erscheint auf dem Bildschirm.
Das Baum-Ergebnis wird automatisch als “FileName.nex.con” gespeichert werden. Dieser Baum-Datei kann geöffnet und bearbeitet von Volksheiligen und in Volksheiligen angezeigte Zahl weiter um es besser geeignet für die Veröffentlichung geändert werden kann.
In dieser Studie wurden 228 süße Proteine, einschließlich 35 Süßigkeiten aus einzelligen Eukaryoten und 57 SemiSWEETs von Prokaryoten, exemplarisch analysiert. Die Süßigkeiten und SemiSWEETs zeichneten sich als Glukose, Fruktose oder Saccharose Transporter über Membranen12,13. Phylogenetische Analyse deutet darauf hin, dass die beiden MtN3/Speichel-Domänen mit Süßigkeiten aus eine evolutionäre Mischung aus einer bakteriellen SemiSWEET und ein Archaeon14abgeleitet werden könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wird in der biologischen Forschung einen Phylogenetischen Baum ausgehend von Nukleotid oder Aminosäure-Sequenzen8immer beliebter. Generell gibt es drei wichtige Phasen der Übung einschließlich Sequenzalignment, Bewertung der ausgerichteten Sequenzen mit der richtigen Methode oder Algorithmus und Visualisierung von das rechnerische Ergebnis als phylogenetischer Baum. In der vorliegenden Studie wurden drei Runden von Sequenzalignment durchgeführt: Zunächst waren die süßen Proteinsequenzen,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31371596), Bio-Technology Research Center, China drei-Schluchten-Universität (2016KBC04) und die naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Jiangsu, China (BK20151424) unterstützt.
Materials
| Adobe Illustration | a graphical tool developed by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright © 2017 | ||
| BioEdit | a biological sequence alignment editor written for Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Copyright © Tom Hall | ||
| Clustal Omega | a package for making multiple sequence alignments of amino acid or nucleotide sequences. http://www.clustal.org/ | ||
| CorelDRAW | a graphic design software. Copyright © 2017 Corel Corporation | ||
| FigTree | a graphical viewer of phylogenetic trees designed by the University of Edinburgh | ||
| MEGA | MolecularEvolutionary Genetics Analysis version6.0 http://www.megasoftware.net/home | ||
| MrBayes | an Bayesian phylogenetic inference tool | ||
| NVIDIA | a company designs graphics processing units (GPUs) for the gaming and professional markets. Corporation Copyright © 2017 | ||
| PAUP | Phylogenetic Analysis Using Parsimony. David Swofford's program implements the maximum likelihood method under a number of nucleotide models. | ||
| Photoshop | a raster graphics editor developed and published by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright © 2017 | ||
| RHYTHM | a knowledge based prediction of hekix contacts. Charité Berlin – Protein Formatics Group – Copyright 2007-2009 | ||
| TMHMM | a tool for prediction of transmembrane helices in proteins. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ | ||
| Compter | 4GB memory, Core 2 or above CPU. Windows 7, Windows 10 |
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