Sammlung von Post-Paarung Sperma aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane und Messung von Sperma Verflüssigung bei Mäusen
Summary
Sperma-Verflüssigung ist erforderlich für das Sperma aus dem bahnbrechenden Gel befreit zu werden. Diese Studie liefert die Verfahren für das Sammeln von Samen aus dem weiblichen Genitaltrakt Post-Beischlaf und Sperma Verflüssigung Messzeit.
Abstract
Bei Mäusen lagert sich ejakuliert Sperma in die Gebärmutter. Nach der Ejakulation, ändert sich das Sperma von Gel-artige Konsistenz zu wässrig, einen Prozess namens Verflüssigung. In der vorliegenden Studie zeigen wir, wie das Post-ejakuliert Sperma von der weiblichen Fortpflanzungsorgane in einem Mausmodell zu sammeln. Erste, Erwachsene weibliche Mäuse in der Brunst waren über Nacht in einem männlichen Käfig untergebracht. Am nächsten Morgen bestätigte das Vorhandensein von copulator Stecker an die vaginale Öffnung Kopulation. Weibliche Mäuse mit copulator Stecker wurden eingeschläfert, und jeder Fortpflanzungsorgane wurden als Ganzes (Scheide, Gebärmutter, Eileiter, Eierstöcke), gewährleistet ein geschlossenes System, das Sperma enthalten. Die Fortpflanzungsorgane in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde, und die Scheide war, lassen Sie das Sperma in das Rohr abgeschnitten. Um maximale Samenvolumen für die Analyse zu gewährleisten, dienten zahnlose Zange, die uterine Hörner vom Eierstock Ende vaginalen Ende wegtreiben restlichen Sperma zu quetschen. Die gesamte Fortpflanzungsorgane wurde dann verworfen. Die Sperma-haltigen Röhre wurde kurz nach unten gesponnen. 25 μL Kapillare Pipette wurde in das Rohr in einem Winkel von 180° (Parallel zur Rohrwand) gelegt. Die Zeit genutzt, um das Kapillarrohr, 25 μL Linie zu füllen wurde aufgezeichnet. Sperma von einem bewährten männlichen Züchter dauert in der Regel ca. 60-180 s, ein 25 μL Kapillarrohr zu füllen. Diese Samen-Kollektion-Technik kann auch in anderen downstream-Anwendungen wie Bildbearbeitung und Motilität Spermiogramm verwendet werden.
Introduction
Die weiblichen Fortpflanzungsorgane besteht aus der oberen und unteren Flächen. Den oberen Genitaltrakt umfasst Eileiter, die Gebärmutter und die Endocervix. Die unteren Genitaltrakt umfasst das Ectocervix und der Vagina. Beim Menschen ist das Sperma ejakuliert an der vorderen Wand der Vagina, angrenzend an das Ectocervix1hinterlegt. Bei Mäusen jedoch wird das Sperma in die Gebärmutter innerhalb von Minuten nach der Paarung2gefegt.
Sperma enthält wegweisende Gel, das ist innerhalb von Sekunden der Ejakulation, verursacht die Spermien zu gefangen werden verfestigt und3immobilisiert. Verflüssigung löst das immobilisierte Sperma indem Sie Sperma aus einem gelartigen in eine wässrige Konsistenz ändern. Dieser Prozess ist unerlässlich für die Beweglichkeit der Spermien und Säugetieren Reproduktion. Kenntnis der Samen Verflüssigung basiert hauptsächlich auf in-vitro- Studien, wo Sperma in der Kulturschale verflüssigt wird. Beim Menschen ist die enzymatische Aktivität der Prostata-spezifisches Antigen oder PSA (auch bekannt als Kallikrein-bezogene Peptidase 3 oder KLK3) den größten Anteil zur Verflüssigung durch Hydrolyse von Semenogelins (Gel-bildende Proteine in der Samenflüssigkeit vorhanden)4 ,5,6. Abbau von Semenogelins befreit die Spermien von der bahnbrechenden Koagulum, zunehmende Mobilität der Spermien. Befreit Spermien schwimmen in Richtung Eileiter auf das Ei zu befruchten. Verflüssigung (oder Samen Viskosität) Tests sind eines der standard ersten Vorführungen für Spermiogramm in Fruchtbarkeitskliniken männliche Ergiebigkeit7bewerten.
Ein kürzlich erschienenen Artikel zeigt, dass die Analyse der Samenflüssigkeit gesammelt aus der Maus weiblichen Genitaltrakt Post-Verpaarung verwendet werden, um einen Mangel an Verflüssigung zu illustrieren, die anschließend Fruchtbarkeit Defekte8verursachen können. Defekte Verflüssigung wie Sperma Hyperviskosität trägt zur 11,8-32,3 % der unfruchtbaren Fälle Männer9, darauf hindeutet, dass normale Verflüssigung für Säugetier-Wiedergabe unabdingbar ist. Jedoch haben Studien und Behandlung der Verflüssigung Mängel ausschließlich auf die männlichen7konzentriert. Die Möglichkeit, dass die weiblichen Fortpflanzungsorgane eine Rolle bei der Verflüssigung des Samens spielt ist nicht untersucht worden. Daher werden die Methoden zur Samengewinnung und Verflüssigung Messzeit Forscherinnen eine neuartige Diagnose-Tool um festzustellen, ob Verflüssigung eine der Ursachen der Unfruchtbarkeit bei Modellorganismus von Interesse sein könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammeln von Samen von Maus Uteri bieten Vorteile gegenüber Samen Analyse in Vitro wie die ehemaligen die physiologischen Wechselwirkungen zwischen den Samen und das Sekret aus der weiblichen Fortpflanzungsorgane. zeigen können In dieser Studie vorgestellten Techniken erlauben Forschern, Qualität des Spermas sowie Spermien Rentabilität und Motilität in physiologischen Voraussetzungen zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es verschiedene nachgelagerte Auswertungen, die mit den Samen gesammelt aus den Ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt vom Anschubfonds College of Veterinary Medicine (WSU), WW. Die Autoren danken Sierra Olsen (WSU) für kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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