Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)
Summary
Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.
Abstract
Desarrollo del cerebro humano se desarrolla a través de una serie de procesos precisamente orquestadas, con etapas anteriores distinguidos por la proliferación, la migración y la consecuencia del neurite; y etapas posteriores, caracterizadas por la formación de fruto y sinapsis axón/dendrita. En trastornos del desarrollo neurológico, a menudo uno o más de estos procesos se interrumpen, conduciendo a anormalidades en la formación del cerebro y la función. Con el advenimiento de la tecnología de la célula de vástago (hiPSC) pluripotentes inducidas humanas, los investigadores ahora tienen una fuente abundante de células humanas que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, incluyendo las neuronas. Estas células pueden utilizarse para estudiar el desarrollo cerebral normal y patogénesis de la enfermedad. Un número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar enfermedades neuropsiquiátricas uso terminal distinguido neuronas o uso cultura 3D sistemas llaman organoides. Mientras que estos métodos han probado inestimables en el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana, existen algunos inconvenientes. Diferenciación de hiPSCs en neuronas y la generación de organoides son procesos largos y costosos que pueden afectar el número de experimentos y las variables que pueden evaluarse. Además, mientras que organoides y poste-mitotic neuronas permiten el estudio de los procesos relacionados con la enfermedad, como consecuencia de la dendrita y sinaptogénesis, impide el estudio de anteriores procesos como proliferación y migración. En trastornos del neurodesarrollo como autismo, abundante evidencia genética y post-mortem indica defectos en los procesos de desarrollo tempranos. Células precursoras neuronales (PNJ), una población altamente proliferativa de la célula, pueden ser un modelo adecuado en el que hacer preguntas sobre los procesos ontogenéticos y la iniciación de la enfermedad. Ahora extendemos metodologías aprendidas del estudio de desarrollo en ratón y rata culturas corticales a NPCs humanos. El uso de NPCs nos permite investigar los fenotipos relacionados con la enfermedad y definir cómo diferentes variables (p. ej., factores de crecimiento, medicamentos) impacto del desarrollo procesos como proliferación, migración y diferenciación en pocos días. En definitiva, este conjunto de herramientas puede utilizarse de forma reproducible y alto rendimiento para identificar mecanismos específicos de la enfermedad y fenotipos en trastornos del neurodesarrollo.
Introduction
El uso de organismos más simples y modelos de ratón ha dilucidado los mecanismos de desarrollo básico del cerebro así como la patogénesis de la enfermedad. A pesar de estos avances, la etiología de muchos desordenes neuropsiquiátricos permanece esquiva porque no todos los resultados en los organismos más simples son directamente pertinentes a aspectos complejos de la enfermedad humana. Además, la mayor complejidad del cerebro humano a menudo hace difícil para el desarrollo humano modelo y trastornos en los animales. Con la evolución y progreso de la tecnología de células madre (hiPSCs) pluripotentes inducidas humanas, células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre y entonces diferenciar en células neuronales para estudiar enfermedades humanas. Avances en las tecnologías hiPSCs y “ómicas” (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica) prometen revolucionar la comprensión del desarrollo del cerebro humano. Estas tecnologías ahora hacen posible un enfoque de “medicina de precisión” a la caracterización de enfermedades neuropsiquiátricas en caso por caso.
La grapa tipo actual en el campo de la enfermedad-modelado hiPSC es diferenciar las células en determinados subtipos neuronales en una monocapa o utilizar un sistema de cultivo 3D llamado un organoide para recapitular los aspectos del cerebro desarrollo1,2, 3. Estos sistemas han sido increíblemente valiosos en el estudio y descubrimiento de aspectos singulares del desarrollo humano y la enfermedad4,5,6,7. Sin embargo, culturas neuronales y organitas a menudo requieren en cualquier lugar desde semanas a meses en la cultura antes de estar listos para estudiar. La naturaleza desperdiciadora de tiempo de estos protocolos y la cantidad de recursos necesarios para mantener que estos sistemas de cultivo a menudo limitan el número de experimentos que se pueden realizar y el número de variables (como factores de crecimiento o drogas) que se puede probar. Por otra parte, muchos estudios utilizando organoides y poste-mitotic neuronas se han centrado en procesos como la formación del fruto o sinapsis dendrita, que ocurren más adelante en el desarrollo. Mientras que estos procesos han sido implicados en la patología de trastornos del desarrollo tales como autismo y esquizofrenia, antes del desarrollo eventos que ocurren antes de la diferenciación neuronal definitiva también son importantes para la patogénesis de la enfermedad8 ,9,10,11,12,13. De hecho, recientes estudios genómicos muestran que el período mediados de-fetal, que se compone de la migración, proliferación y consecuencia del proceso, es particularmente importante en la patogenesia de autismo11,14. Por lo tanto, es importante estudiar el tallo neural y poblaciones de la célula progenitora para entender mejor estos procesos anteriores. Sistemas de organoide, que están considerado mejor Recapitulemos el desarrollo del cerebro humano debido a su naturaleza 3D y estructura organizada, contienen una piscina del progenitor que se ha utilizado para estudiar algunos de estos eventos anteriores. Sin embargo, a menudo es escasa la población progenitora de organoides y más como las células gliales radiales que nervios madre o progenitora células5,15. Por lo tanto, sería beneficioso tener un método de alto rendimiento para estudiar las primeras etapas de desarrollo neurológico en una población activamente proliferativa de la célula.
En el laboratorio, hemos creado un protocolo que utiliza células precursora neuronal hiPSC derivados (PNJ), una población mezclada del tallo neural y células progenitoras que es altamente proliferativas, para el estudio del neurodesarrollo procesos como proliferación, migración de la célula, y extensión del proceso inicial (neurita). Estos ensayos se desarrollaron de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio durante décadas para estudiar con éxito neurodesarrollo en rata y ratón culturas corticales16,17,18,19,20, 21,22,23. Lo importante, también fue demostrado que señales regulatorias definidas en los sistemas de cultivo de rata y ratón y fenotipos son altamente predictivas de mecanismos que son activos en vivo, indicando el valor de estas técnicas16, 1718,de,19,24. Tras la diferenciación inicial de hiPSCs a NPCs, estos métodos nos permiten estudiar los procesos de desarrollo vitales en cuestión de días. Estos métodos tienen muchas ventajas: (1) requieren equipos poco sofisticados y son fáciles de implementar, (2) numerosas repeticiones experimentales pueden llevarse a cabo en un corto periodo de tiempo, lo que permite la confirmación rápida de la reproducibilidad de los resultados y (3) variables de cultura como matrices de capa, efectos de factores de crecimiento y actividad de las drogas se pueden probar rápidamente y rentable. Además, aprovechamos el papel bien establecido extracelulares de factores de crecimiento como reguladores críticos de diversos procesos de desarrollo. NPCs fueron expuestas para seleccionar las señales del desarrollo que directamente estimulan eventos como proliferación, consecuencia del neurite y migración celular y han encontrado que aumentar la capacidad de identificar defectos que no son evidentes en condiciones de control19 , 25 , 26 , 27 , 28. Asimismo, la facilidad de evaluar drogas ofrece una vía poderosa para adoptar técnicas de la medicina de precisión para comprobar la eficacia de diferentes intervenciones terapéuticas. Así, este protocolo facilita un alto rendimiento, reproducible y sencilla metodología para estudiar el desarrollo temprano del cerebro, patogénesis de la enfermedad y los efectos beneficiosos potenciales factores de crecimiento y fármacos en fenotipos del neurodesarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos presentados aquí ilustran métodos rápidos y simples para estudiar los procesos fundamentales del desarrollo neurológico y factores de crecimiento y fármacos mediante células precursoras neuronales derivados de hiPSC. hiPSC tecnología ha revolucionado el estudio de la patogénesis de las enfermedades del neurodesarrollo nos proporciona un acceso sin precedentes a vivir las células neuronales humanas de los individuos afectados. De hecho, se han realizado numerosos estudios hiPSC de trastornos del de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo del gobernador de Nueva Jersey para investigación médica y el tratamiento del autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca Family Foundation, Mindworks fondo plomo benéfico y la Fundación de la comunidad judía de Nueva Jersey mayor de MetroWest.
Materials
| PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
| 6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
| 24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
| 35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
| 2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
| tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
| Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
| LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
| Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
| Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
| Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
| Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |
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