Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

A utilização de organismos mais simples e modelos de rato tem elucidados os mecanismos do desenvolvimento cerebral básica, bem como a patogênese da doença. Apesar destes avanços, a etiologia de muitos distúrbios neuropsiquiátricos continua elusiva, porque nem todos os achados em organismos mais simples são diretamente relevantes para os aspectos complexos das doenças humanas. Além disso, a maior complexidade do cérebro humano muitas vezes torna difícil para o modelo de desenvolvimento humano e distúrbios nos animais. Com a evolução e o progresso da tecnologia de células-tronco (hiPSCs) humanas pluripotentes induzidas, as células somáticas podem ser reprogramadas em células-tronco e em seguida diferenciadas em células neuronais para estudar doenças humanas. Avanços em tecnologias hiPSCs e “omic” (genômica, transcriptomics, proteômica, metabolomics) prometem revolucionar a compreensão do desenvolvimento do cérebro humano. Estas tecnologias agora tornam possível uma abordagem de “medicina de precisão” para a caracterização das doenças neuropsiquiátricas em uma base caso-a-caso.

O grampo atual no campo de modelagem de doença hiPSC é para diferenciar as células em subtipos neuronais específicos em uma monocamada ou usar um sistema de cultura 3D chamado um organoides para recapitular aspectos do cérebro desenvolvimento^{1,2, 3}. Estes sistemas foram incrivelmente valiosos em estudando e descobrindo aspectos únicos do desenvolvimento humano e doença^4,5,6,7. No entanto, tanto culturas neuronal e organoids muitas vezes exigem em qualquer lugar de semanas a meses na cultura antes de estarem prontos para estudar. A natureza demorada esses protocolos e o montante dos recursos necessários para manter que estes sistemas de cultura muitas vezes limitam o número de experiências que podem ser executadas e o número de variáveis (como fatores de crescimento ou drogas) que podem ser testados. Além disso, muitos estudos utilizando organoids e neurônios pós mitóticos concentraram-se em processos como formação de consequência ou sinapse dendrito, que ocorrem mais tarde, em desenvolvimento. Enquanto estes processos têm sido implicados na patologia dos transtornos globais do desenvolvimento como autismo e esquizofrenia, no início do desenvolvimento eventos que ocorrem antes de diferenciação neuronal definitiva também são importantes para a patogênese da doença^{8 ,9,10,11,12,13}. De fato, estudos genômicos recentes mostram que o período de meados de-fetal, que é composto de proliferação, migração e consequência natural do processo, é particularmente importante na patogênese de autismo^11,14. Assim, é importante estudar o tronco neural e populações de células progenitoras para entender melhor estes processos anteriores. Sistemas de organoides que são recapitular considerado para melhor desenvolvimento do cérebro humano devido à sua natureza 3D e estrutura organizada, contêm um pool de progenitor que tem sido utilizado para estudar alguns desses eventos anteriores. No entanto, a população do progenitor em organoids muitas vezes é escassa e mais como células gliais radiais que neural tronco ou progenitoras células^5,15. Assim, seria benéfico ter um método de alto throughput para estudar os estágios iniciais de neurodesenvolvimento em uma população de células ativamente proliferativa.

No laboratório, nós criamos um protocolo que utiliza células precursoras neurais hiPSC-derivado (NPCs), uma população mista de haste neural e de células progenitoras que é altamente proliferativas, para estudar processos de desenvolvimento neurológico, como a proliferação, migração celular, e extensão do processo inicial (axônio). Estes ensaios foram desenvolvidos a partir de técnicas utilizadas em nosso laboratório durante décadas para estudar com sucesso neurodesenvolvimento em rato e rato culturas cortical^{16,17,18,19,20, 21,22,23}. Importante, também foi mostrado que fenótipos e sinais regulamentares definidos nos sistemas de cultura de rato e rato são altamente preditivos dos mecanismos que estão ativos na vivo, indicando o valor destas técnicas^{16, 17,18,19,24}. Após a diferenciação inicial de hiPSCs para NPCs, estes métodos permitem estudar processos de desenvolvimento vitais, em questão de dias. Esses métodos têm muitas vantagens: (1) exigem equipamentos pouco sofisticados e são fáceis de implementar, (2) numerosas repetições experimentais podem ser realizadas em um curto período de tempo, permitindo a rápida confirmação da reprodutibilidade dos resultados e (3) variáveis de cultura como matrizes de revestimento, os efeitos de fatores de crescimento e atividade de fármacos podem ser testadas de forma rápida e econômica. Além disso, aproveitamos o papel bem estabelecido extracelulares de fatores de crescimento como reguladores da críticos dos diversos processos de desenvolvimento. NPCs foram expostos para selecionar sinais do desenvolvimento que diretamente estimulam eventos como consequência de axônio, proliferação e migração celular e tem encontrado que eles aprimoram a capacidade de identificar defeitos que não são aparentes em condições de controle^{19 , 25 , 26 , 27 , 28}. da mesma forma, a facilidade de avaliar drogas fornece uma poderosa Avenida para adotar técnicas de medicina de precisão para testar a eficácia de diversas intervenções terapêuticas. Assim, este protocolo facilita um alto throughput, reprodutível e uma metodologia simples para estudar o desenvolvimento precoce do cérebro, patogênese da doença e os potenciais efeitos benéficos de drogas e fatores de crescimento no desenvolvimento neurológico fenótipos.