Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция
Summary
Протокол для синтеза, очистки и характеристика рутений основе ингибиторов митохондриальных кальция поглощения представлен. Демонстрируется процедура для оценки ее эффективности в permeabilized клетках млекопитающих.
Abstract
Мы подробно синтеза и очистки ингибиторов митохондриальных кальция поглощения, [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)]5 +. Оптимизированный синтез этого соединения начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2 в 1 М NH4OH в закрытом контейнере, давая зеленый раствор. Очистка осуществляется с катионообмен хроматографии. Это вещество характеризуется и UV-vis и ИК-спектроскопии проверены, чтобы быть чистым. В permeabilized клетки HeLa митохондриальной кальция поглощение ингибирующих свойств оцениваются флуоресцентной спектроскопии.
Introduction
Митохондриальной Кальций является ключевым регулятором для целого ряда процессов, которые имеют решающее значение для нормальной клеточной функции, включая производство энергии и апоптоз. 1 , 2 , 3 Унипорт митохондриальных кальция (MCU), Ион транспортер белок, который находится на внутренней митохондриальной мембраны, регулирует приток ионов кальция в митохондрии. 4 , 5 , 6 химических ингибиторов MCU являются ценными инструментами для продолжения усилий для изучения функции и клеточных роли этого транспортного белка и митохондриальной кальция. Соединения [(2HCO) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, является одним из только известных селективных ингибиторов для Микроконтроллера с заявленной стоимостьюd K 24 µM.7 ,8,9,10 этот комплекс является общей примеси в коммерческих препаратах Рутения красный (RuRed), triruthenium ди µ оксо мост hexacation формулы [(NH-3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, который также использовался как ингибитор поглощение кальция. Хотя Ru360 является коммерчески доступных, это очень дорого. Кроме того обобщение и изоляции Ru360 оспаривается трудно очистительные процедуры и методы неоднозначными характеристике.
Недавно мы сообщили альтернативные процедуры для доступа к аналоговых, Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] Ru3605. 11 это соединение подавляет MCU с высоким сродством, похож на Ru360. В этом протоколе мы будем описывать наши наиболее эффективным синтез этого соединения, который начинается от [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Очистки продукта с помощью настоятельно кислой катионообменной смолы подробно, а также распространенных ошибок для этой процедуры. Мы также методы для характеристики и оценки составных чистоты и определить простой подход к проверить его эффективность в блокирует поглощение митохондриальной кальция.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cl [(2OH) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(2OH)] митохондриальной кальция поглощение ингибитор5 может быть синтезированным из [Ru (NH3)5Cl] Cl2, хорошо известна ruthenium(III) исходный материал, как описано в этой процедуре. Синтез [Ru (NH3)5Cl] Cl2 легко ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Корнельского университета. Эта работа использовала центра Корнелл для материалов исследований общий зал, которые поддерживаются через программу NSF MRSEC (Грант DMR-1120296). S.R.N. признает поддержку стипендий исследований NSF (Грант DGE – 1650441) и доктор Дейв Holowka для помощи с кальция экспериментов. Любые мнения, выводы и выводы или рекомендации, выраженные в этом материале являются те из авторов (s) и не обязательно отражают взгляды национального научного фонда.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
