Sintesi e valutazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale a base di rutenio
Summary
Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell’assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.
Abstract
Dettagliamo la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]+ 5. La sintesi ottimizzata di questo composto ha inizio dalla [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1m NH4OH in un contenitore chiuso, ottenendo una soluzione verde. Purificazione viene eseguita mediante cromatografia a scambio cationico. Questo composto è caratterizzato e verificato per essere puro mediante spettroscopia UV-vis e IR. Le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale sono valutate in cellule HeLa permeabilized dalla spettroscopia di fluorescenza.
Introduction
Calcio mitocondriale è un regolatore chiave per un certo numero di processi che sono fondamentali per la funzione normale delle cellule, tra cui l’apoptosi e la produzione di energia. 1 , 2 , 3 il calcio mitocondriale uniporter (MCU), una proteina del trasportatore dello ione che si trova sulla membrana mitocondriale interna, regola l’afflusso degli ioni di calcio nei mitocondri. 4 , 5 , 6 inibitori chimici della MCU sono strumenti preziosi per proseguire gli sforzi per studiare la funzione e i ruoli cellulari di questa proteina di trasporto e di calcio mitocondriale. Il composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, è uno degli inibitori selettivi noti soli per la MCU con un valore did K riferito di 24 µM.7 ,8,9,10 , questo complesso è una comune impurità trovata in formulazioni commerciali del rutenio rosso (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo “a ponte” hexacation della formula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, che è stato utilizzato anche come un inibitore di assorbimento del calcio. Anche se Ru360 è disponibile in commercio, è molto costoso. Inoltre, la sintesi e l’isolamento di Ru360 è sfidato da purificazione difficili procedure e metodi di caratterizzazione ambigua.
Recentemente abbiamo segnalato procedure alternative per accedere un Ru360 analogici, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 questo composto inibisce la MCU con alta affinità, simile a Ru360. In questo protocollo, descriveremo la nostra sintesi più efficace di questo composto, che comincia da [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificazione del prodotto utilizzando la resina a scambio cationico fortemente acido è dettagliato, insieme a trabocchetti comuni per questa procedura. Inoltre presentiamo metodi di caratterizzazione e valutazione della purezza del composto e delineare un approccio semplice per testare la sua efficacia nel bloccare l’assorbimento di calcio mitocondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 può essere sintetizzato da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un ruthenium(III) ben noto a partire del materiale, come descritto in questa procedura. La sintesi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 è realizzata prontamente con poca difficoltà. Dopo agitazione RuCl3 per 16 h in idrazina idrato, il pH della solu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cornell University. Questo lavoro fatto uso del Cornell Center per servizi in comune ricerca materiali, che sono supportati tramite il programma NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. riconosce il sostegno di un NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE – 1650441) e Dr. Dave Holowka per assistenza con gli esperimenti di calcio. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
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