Automatisk snabb iterativ negativa Geotaxis test för analysera vuxen klättring beteende i Drosophila modell för Neurodegeneration
Summary
Detta stegvisa protokoll analyserar Drosophila negativa geotaxis beteende med hjälp av ett automatiserat flercylindriga system som är värd hundratals flugor och synkroniserar sina åtgärder av en elmotor. Vid synkronisering, har flyga negativa geotaxis beteende analyserats, digitalt inspelade och analyseras med hjälp av egendesignade RflyDetection programvara.
Abstract
Neurodegenerativa sjukdomar är ofta associerade med en progressiv förlust av rörelse förmåga, minskad livslängd och åldersberoende neurodegeneration. För att förstå mekanismen av dessa cellulära används händelser och deras kausala relationer med varandra, Drosophila melanogaster, med dess sofistikerade genetiska verktyg och olika beteendemässiga egenskaper, som sjukdomsmodeller för att bedöma neurodegenerativa fenotyper. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för att analysera Drosophila vuxen negativa geotaxis beteende, som en indikation för eventuella motoriska brister är associerad med neurodegeneration. En automatiserad maskin är utformad och utvecklad till drive flyga synkronisering med en inledande elektrisk impuls, senare tillåter inspelning av negativa geotaxis beteende under en sekunder till minuter. Bilder från digitalt inspelade videon behandlas sedan med egendesignade RflyDetection programvara för statistisk datamanipulation. Skiljer sig från manuellt styrda negativa geotaxis analysen utifrån enstaka fluga, detta exakt, snabb och hög genomströmning protokoll tillåter datainsamling från mer än hundra flugor samtidigt, ger en effektiv strategi att föra vår förståelse i den underliggande mekanismen vid rörelseapparaten underskott är associerad med neurodegeneration.
Introduction
En mängd protokoll och metoder har utvecklats för att analysera Drosophila vuxen klättring beteende. Ganska mödosam, den traditionella analysen mestadels innebär att sätta en enda fluga in en enskilda injektionsflaskan och använder en manuell kraft för att knacka flyger ner för synkronisering1,2,3,4. Det är tråkiga och tidskrävande, olämpliga för stora hög genomströmning studier och har potentiella variationer av manuell kraft används för att knacka ner flugorna samt andra begränsningar. För att förbättra analysen, utvecklades en snabb iterativ negativa Geotaxis (RING) analys som tillåter hög genomströmning analys över många flugor på samma gång5. Analysen kräver dock fortfarande en manuellt att utöva kraft att synkronisera flyga åtgärder. Vår version av RING analysen, reviderade vid den föregående analysen, inkluderar en metall bas värd flera fluga-innehållande injektionsflaskor kontrolleras automatiskt av en elektrisk motor att köra flyga synkronisering6. Vid inspelning, flugan klättring omedelbart efter synkronisering registreras sedan analyseras med en egendesignade programvara. Våra automatiserade RING assay har elimineras långtråkig och arbetsintensiva processen att samla in data från en enda fluga, en i taget, och aktiverat förvärvsprocessen data effektivare. Dessutom har automatiserade RING analysen varit anställd i ett antal studier för att klarlägga mekanism underliggande Alzheimers och Parkinsons sjukdom, validera metoden med hög effektivitet7,8,9 .
I denna artikel visar vi automatiserad RING analysen använder DDC-Gal4 driven RNAi flugor. DDC-Gal4 är en Gal4 linje specifikt uttrycker i dopaminerga (DA) och serotonerga neuroner, som alltså representerar ett bra verktyg för att analysera de mål genen effekter i samband med rörelseapparaten underskott åtföljer neurodegeneration10. Dessutom, införliva vi UAS-Dicer2, en linan som förbättrar RNAi effektivitet, för att generera UAS-Dicer2; DDC-Gal4 verktyget line. RNAi flugorna vi väljer att använda är den auxilin (aux), RNAi v16182 (auxR16182), en gen som vi har tidigare identifierat att ställa ut en effekt på flyga rörelseaktivitet8. auxGFP flugor är också förberedda för att analysera effekterna på aux överuttryck. Vi visar hur du använder automatiserad RING analysen att mäta flyga negativa geotaxis, presentera resultat och diskutera eventuella konsekvenser som förvärvats från resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Automatiserad RING analysen beskrivs här möjliggör en hög genomströmning analys av flyga negativa geotaxis beteende för hundratals flugor samtidigt. Tidigare befintliga strategier för att analysera vuxen klättring innebär observationer av en enda fluga i en injektionsflaska av enskilda, och flyga position identifieras manuellt av ögat. Denna ganska långtråkig process kan ibland orsaka felläsning eller feltolkning av data, samt arbetsintensiva arbete. Våra automatiserade RING analysen börjar med ett enkelt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Bloomington lager centrum och stadens Vienna Drosophila RNAi för flyga bestånd. Patent för RING apparaten tillhör Shanghai Advanced Research institute, kinesiska vetenskapsakademin. Ansökningar om RflyDetection programvaran bör göras till Fu-de Huang (se författare lista). Detta arbete stöds av bidrag från nationella grundläggande forskning Program i Kina (973 Program 2013CB945602) och National Natural Science Foundation Kina (31270825 och 31171043). Vi tackar Ho lab medlemmar för diskussion och kommentarer.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
