וזמינותו אוטומטית מהירה Geotaxis שלילי איטרטיבי לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים מודל דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים
Summary
פרוטוקול שלב אחר שלב זה מנתח התנהגות שלילית geotaxis דרוזופילה באמצעות מערכת אוטומטית צילינדר רב מארח מאות זבובים ומסנכרן פעולתם על ידי מנוע חשמלי. בעת סינכרון, התנהגות לטוס geotaxis שלילי זה לבדיקה, דיגיטלית המוקלט ולאחר שנותחה שימוש בתוכנת RflyDetection בעיצוב עצמי.
Abstract
מחלות ניווניות קשורות לעתים קרובות אובדן הדרגתי של יכולת תנועה מופחתת תוחלת החיים, תלויי-גיל הקשורים ניוון מוחיים. כדי להבין את המנגנון של אלה הסלולר אירועים, ואת יחסיהם סיבתי אחד עם השני, דרוזופילה melanogaster, עם כלים גנטיים מתוחכמים שלה מגוון תכונות התנהגותיות, משמשים כמודלים מחלות להערכת פנוטיפים ניווניות. כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה כדי לנתח את התנהגות דרוזופילה geotaxis שלילי למבוגרים, כאינדיקציה אפשרי פגמים מוטוריים הקשורים הקשורים ניוון מוחיים. מכונה אוטומטית של נועד ופיתח לסינכרון לטוס כונן באמצעות דחף חשמלי הראשונית, מאוחר יותר ומאפשר את ההקלטה של התנהגות שלילית geotaxis במהלך מספר שניות עד דקות. תמונות מתוך הווידאו המוקלט דיגיטלית מעובדים אז עם התוכנה RflyDetection בעיצוב עצמי עבור נתונים סטטיסטיים מניפולציה. שונה וזמינותו geotaxis שלילי מבוקר באופן ידני בהתבסס על זבוב אחד, פרוטוקול זה מדויק, מהיר, תפוקה גבוהה מאפשר רכישת נתונים יותר מאשר מאות זבובים בו זמנית, מספקים גישה יעילה לקידום שלנו להבנת המנגנון הבסיסי של גינקולוגיות הגירעונות הקשורים הקשורים ניוון מוחיים.
Introduction
פותחו מגוון של פרוטוקולים, שיטות לניתוח התנהגות טיפוס למבוגרים דרוזופילה . די מייגעת, הניתוח המסורתי בעיקר כרוך לשים זבוב אחד לתוך המבחנה בודדים ומשתמש כוח ידני כדי הקש על זבובים למטה עבור סינכרון1,2,3,4. זה מייגע, זמן רב, מתאימים ללימודי תפוקה גבוהה גדולים, יש פוטנציאל וריאציות של הכוח ידנית פעם לנצל את הזבובים, כמו גם מגבלות אחרות. לשיפור וזמינותו, פותחה assay מהירה איטרטיבי שלילי Geotaxis (טבעת) אשר מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה זבובים רבים בבית באותו זמן5. עם זאת, וזמינותו מחייבת עדיין כוח ל”שבירת באופן ידני כדי לסנכרן פעולה לעוף. הגרסה שלנו של הטבעת וזמינותו, מתוקן על וזמינותו הקודם, כולל בסיס מתכת אירוח מרובים בקבוקונים המכילים לטוס באופן אוטומטי נשלט על ידי מנוע חשמלי לנהוג סינכרון לטוס6. על הקלטה, הזבוב טיפוס מיד לאחר סינכרון נרשם אז נותחה באמצעות תוכנת בעיצוב עצמי. Assay טבעת האוטומטי שלנו יש חיסלה את תהליך מייגע מהגידולים באיסוף מידע של זבוב אחד, אחד בכל פעם, והוא מופעל תהליך רכישת נתונים כדי להיות יעיל יותר. בנוסף, וזמינותו טבעת אוטומטיות ננקטה מספר מחקרים כדי להבהיר את המנגנון הבסיסי, אלצהיימר, פרקינסון, אימות הגישה עם יעילות גבוהה7,8,9 .
במאמר זה נדגים וזמינותו טבעת אוטומטית באמצעות DDC-Gal4 מונחה זבובים RNAi. DDC-Gal4 הוא קו Gal4 לבטא במפורש דופאמין (DA), הנוירונים תכולה, ובכך מייצג כלי נהדר עבור ניתוח ההשפעות ג’ין היעד המשויך גירעונות גינקולוגיות הנלווים הקשורים ניוון מוחיים10. בנוסף, אנו משלבים את UAS-Dicer2, קו לטוס משפר את יעילות RNAi, כדי ליצור את UAS-Dicer2; DDC-Gal4 כלי הקו. הזבובים RNAi אנו בוחרים להשתמש הוא auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), גן כי בעבר זיהינו שהפגינו אפקט על טוס גינקולוגיות פעילות8. auxGFP זבובים מוכנים גם ניתוח השפעות רבות על ביטוי aux . אנחנו נראה כיצד להשתמש וזמינותו טבעת אוטומטית כדי למדוד לטוס geotaxis שלילי, להציג את התוצאות ולדון כל השלכות רכשה את התוצאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
וזמינותו טבעת אוטומטיות המתוארים כאן מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות לטוס geotaxis שליליות עבור מאות זבובים בו זמנית. בעבר קיימות אסטרטגיות לניתוח טיפוס למבוגרים לערב תצפיות של זבוב אחד ב המבחנה בודדים, עמדה לטוס מזוהה באופן ידני לפי העין. תהליך מייגע למדי זה עלול לעתים לגרום מהבנה שגויה א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז מניות בלומינגטון ומרכז וינה דרוזופילה RNAi מניות לעוף. המצאתם המנגנון הטבעת שייך מכון מחקר מתקדם של שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים. בקשות בגין התוכנה RflyDetection צריך להיעשות כדי חואנג פו-דה (ראה מחבר הרשימה). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (973 תוכנית 2013CB945602) נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31270825 ו- 31171043). אנו מודים הו חברי המעבדה דיונים והערות.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
