فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن
Summary
ويحلل هذا البروتوكول خطوة بخطوة المورفولوجية جيوتاكسيس السلبية سلوك استخدام نظام اسطوانة متعددة يستضيف مئات ذباب ويزامن أعمالهم بمحرك كهربائي. عند المزامنة، هو جزيئي السلوك جيوتاكسيس السلبية يطير، المسجلة رقمياً، وتم تحليلها باستخدام البرمجيات رفليديتيكشن المصممة ذاتيا.
Abstract
أمراض الأعصاب ترتبط كثيرا فقدان تدريجي لقدرة الحركة وانخفاض العمر المتوقع نيوروديجينيريشن تعتمد على العمر. لفهم هذه الآلية الخلوية هذه الأحداث، وعلاقاتها السببية مع بعضها البعض، melanogaster المورفولوجية، مع أدوات الجينية متطورة ومميزات سلوكية متنوعة، تستخدم كنماذج المرض لتقييم تعمل الأعصاب. هنا يمكننا وصف أسلوب الفائق لتحليل سلوك الكبار جيوتاكسيس السلبية المورفولوجية ، كمؤشر لعيوب السيارات المرتبطة نيوروديجينيريشن. جهاز الآلي تم تصميمه وتطويره بالتزامن يطير محرك الأقراص باستخدام دفعة كهربائية أولية، في وقت لاحق مما يتيح تسجيل السلوك السلبي جيوتاكسيس وخلال ثوان إلى دقيقة. ثم تتم معالجة الصور من الفيديو المسجلة رقمياً مع برنامج رفليديتيكشن الذاتي المصممة لمعالجة البيانات الإحصائية. مختلفة من الإنزيم جيوتاكسيس السلبية التي تسيطر عليها يدوياً استناداً إلى ذبابة واحدة، يسمح هذا البروتوكول دقيقة وسريعة، والفائق الحصول على البيانات من أكثر من مئات ذباب في الوقت ذاته، توفير نهج فعالة للنهوض بموقعنا فهم في هذه الآلية الكامنة وراء العجز الحركي المرتبطة نيوروديجينيريشن.
Introduction
وقد وضعت مجموعة متنوعة من بروتوكولات وأساليب لتحليل سلوك التسلق الكبار المورفولوجية . بل شاقة، التحليل التقليدي معظمها ينطوي على وضع ذبابة واحدة قنينة فردية ويستخدم قوة يدوية للاستفادة من الذباب إلى أسفل لمزامنة1،2،3،4. هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وغير ملائمة للدراسات العالية الإنتاجية الكبيرة، والاختلافات المحتملة للقوة اليدوية المستخدمة للاستفادة من انخفاض الذباب، فضلا عن القيود الأخرى. تحسين المقايسة، وضعت مقايسة جيوتاكسيس سلبية تكرارية سريع (الدائري) الذي يسمح تحليل الفائق على مدى العديد من الذباب في الوقت نفسه5. بيد الفحص لا يزال يتطلب قوة ممارسة يدوياً لمزامنة العمل يطير. لدينا نسخة التحليل الدائري، نقحت بناء على التحليل السابق، يتضمن قاعدة معدنية لاستضافة عدة قنينات المحتوية على الطاير تلقائياً يسيطر عليها محرك كهربائي محرك تزامن يطير6. عند التسجيل، حلل الطاير تسلق فورا بعد أن يتم تسجيل المزامنة ثم استخدام برمجيات مصممة ذاتيا. لدينا المقايسة خاتم الآلي إلغاء عملية شاقة وتتطلب عمالة مكثفة في جمع البيانات من ذبابة واحدة، واحدة في كل مرة، وتمكين عملية الحصول على البيانات لتكون أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت مقايسة خاتم الآلي في عدد من الدراسات توضيح الآلية الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التحقق من صحة النهج مع كفاءة عالية7،8،9 .
في هذه المقالة، نبدي المقايسة خاتم الآلي باستخدام DDC Gal4 مدفوعة [رني] الذباب. DDC-Gal4 خط Gal4 على وجه الخصوص معربا عن تتميز (دا) وهرمون السيروتونين من الخلايا العصبية، وبالتالي تمثل أداة عظيمة لتحليل تأثيرات الجينات المستهدفة المرتبطة بالعجز الحركي المرافقين نيوروديجينيريشن10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا إدراج UAS-Dicer2، خط الطيران الذي يعزز كفاءة [رني]، لتوليد UAS-Dicer2؛ DDC-Gal4 أداة الخط. [رني] الذباب نختار لاستخدام هو أوكسيلين (aux) v16182 [رني] (عازر16182)، تطير جينات التي حددناها سابقا المعرض لها تأثير على النشاط الحركي8. أوكسجفب الذباب مستعدون أيضا لتحليل آثار aux overexpression. ونحن سوف تظهر كيفية استخدام التحليل الدائري الآلي لقياس يطير جيوتاكسيس السلبية وتقديم النتائج ومناقشة أي آثار تم الحصول عليها من النتائج.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسة خاتم الآلي الموصوفة هنا يتيح تحليلاً الفائق للسلوك جيوتاكسيس السلبية يطير لمئات ذباب في وقت واحد. سابقا تنطوي الاستراتيجيات القائمة لتحليل تسلق الكبار ملاحظات ذبابة واحدة في قنينة فردية، والكشف عن موقف يطير يدوياً بواسطة العين. في بعض الأحيان قد يسبب هذه العملية شاقة بدلاً من قرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر مركز الأسهم بلومينغتون و المورفولوجية فيينا مركز [رني] مخزونات يطير. البراءة للجهاز الدائري الذي ينتمي إلى معهد “البحوث المتقدمة في شانغهاي”، الأكاديمية الصينية للعلوم. طلبات للبرامج رفليديتيكشن ينبغي أن هوانغ دي فو (انظر قائمة مقدم البلاغ). بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من “الوطنية الأساسية البحث البرنامج الصيني” (2013CB945602 برنامج 973) و “الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية” (31270825 و 31171043). ونشكر أعضاء المختبر هو للمناقشة والتعليقات.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
