एक स्वचालित रैपिड चलने नकारात्मक Geotaxis परख Neurodegeneration के एक Drosophila मॉडल में वयस्क चढ़ाई व्यवहार का विश्लेषण के लिए
Summary
यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल एक स्वचालित बहु-सिलेंडर प्रणाली है कि मक्खियों के सैकड़ों मेजबान और एक बिजली के मोटर द्वारा अपनी कार्रवाई सिंक्रनाइज़ का उपयोग कर Drosophila नकारात्मक geotaxis व्यवहार का विश्लेषण करती है । तुल्यकालन पर, मक्खी नकारात्मक geotaxis व्यवहार परख, डिजिटल दर्ज की गई है, और स्वयं का उपयोग कर RflyDetection सॉफ्टवेयर डिजाइन का विश्लेषण किया ।
Abstract
Neurodegenerative रोग अक्सर आंदोलन की क्षमता का एक प्रगतिशील हानि के साथ जुड़े रहे हैं, कम जीवन अवधि, और उंर पर निर्भर neurodegeneration । इन सेलुलर घटनाओं के तंत्र को समझने के लिए, और एक दूसरे के साथ उनके कारण संबंधों, Drosophila melanogaster, अपने परिष्कृत आनुवंशिक उपकरणों और विविध व्यवहार सुविधाओं के साथ, आकलन के लिए रोग मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं neurodegenerative phenotypes. यहां हम एक उच्च प्रवाह विधि का वर्णन करने के लिए Drosophila वयस्क नकारात्मक geotaxis व्यवहार का विश्लेषण, संभव मोटर neurodegeneration के साथ जुड़े दोषों के लिए एक संकेत के रूप में । एक स्वचालित मशीन डिजाइन और मक्खी एक प्रारंभिक बिजली के आवेग का उपयोग कर तुल्यकालन ड्राइव विकसित की है, बाद में सेकंड के एक पाठ्यक्रम पर नकारात्मक geotaxis व्यवहार की रिकॉर्डिंग मिनट के लिए अनुमति । डिजिटल रिकॉर्ड किए गए वीडियो से छवियां तब सांख्यिकीय डेटा हेरफेर के लिए स्व-डिज़ाइन RflyDetection सॉफ़्टवेयर के साथ संसाधित की जाती हैं । मैंयुअल रूप से नियंत्रित नकारात्मक geotaxis एक मक्खी पर आधारित परख से अलग है, यह सटीक, तेज, और उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल एक साथ मक्खियों के सैकड़ों से अधिक से डेटा अधिग्रहण की अनुमति देता है, एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए अग्रिम हमारे neurodegeneration के साथ जुड़े हरकत घाटे के अंतर्निहित तंत्र में समझौता.
Introduction
प्रोटोकॉल और तरीकों की एक किस्म Drosophila वयस्क चढ़ाई व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है । बल्कि श्रमसाध्य, पारंपरिक विश्लेषण ज्यादातर एक व्यक्ति की शीशी में एक मक्खी डाल शामिल है और एक मैनुअल बल का उपयोग करता है तुल्यकालन के लिए नीचे मक्खियों1,2,3,4। यह थकाऊ और समय लेने वाली है, बड़े उच्च प्रवाह अध्ययन के लिए अनुपयुक्त है, और मैनुअल के लिए नीचे मक्खियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय सीमाओं नल इस्तेमाल बल के संभावित रूपों है । परख में सुधार करने के लिए, एक तेजी से चलने नकारात्मक Geotaxis (अंगूठी) परख विकसित की है जो एक ही समय में कई मक्खियों पर उच्च प्रवाह विश्लेषण की अनुमति देता है5। हालांकि, परख अभी भी एक मैंयुअल रूप से करने के लिए मक्खी कार्रवाई सिंक्रनाइज़ बल लागू की आवश्यकता है । अंगूठी परख के हमारे संस्करण, पिछले परख पर संशोधित, एक धातु के आधार पर कई मक्खी युक्त शीशियों स्वचालित रूप से एक बिजली के मोटर द्वारा नियंत्रित करने के लिए उड़ान भरने के तुल्यकालन6ड्राइव की मेजबानी भी शामिल है । रिकॉर्डिंग पर, तुल्यकालन के बाद तुरंत चढ़ाई तो एक आत्म डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण दर्ज की गई है । हमारे स्वचालित अंगूठी परख एक ही मक्खी से डेटा इकट्ठा करने में थकाऊ और परिश्रम गहन प्रक्रिया समाप्त हो गया है, एक समय में एक, और डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया सक्षम करने के लिए और अधिक कुशल हो । इसके अलावा, स्वचालित अंगूठी परख है अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट करने के लिए अध्ययन की एक संख्या में कार्यरत है, उच्च दक्षता के साथ दृष्टिकोण मांय कर रहा है7,8,9 .
इस अनुच्छेद में, हम स्वचालित अंगूठी परख प्रदर्शन का उपयोग कर डीडीसी-Gal4 चालित RNAi मक्खियों । डीडीसी-Gal4 एक Gal4 लाइन विशेष रूप से dopaminergic (डीए) और serotonergic ंयूरॉंस में व्यक्त कर रही है, इस प्रकार हरकत घाटे के साथ जुड़े लक्ष्य जीन प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक महान उपकरण का प्रतिनिधित्व neurodegeneration10के साथ । इसके अलावा, हम यूएएस-Dicer2, एक मक्खी लाइन है कि RNAi क्षमता को बढ़ाता है, को शामिल करने के लिए यूएएस-Dicer2 उत्पंन; डीडीसी-Gal4 टूल लाइन । RNAi मक्खियों हम का उपयोग करने का चयन auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR१६१८२), एक जीन है कि हम पहले से मक्खी हरकत गतिविधि8पर एक प्रभाव प्रदर्शित करने के लिए पहचान की है । auxGFP मक्खियों भी aux एक्सप्रेस पर प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं । हम कैसे स्वचालित अंगूठी परख का उपयोग करने के लिए नकारात्मक geotaxis मक्खी उपाय दिखाने के लिए, परिणाम वर्तमान, और किसी भी परिणाम से प्राप्त निहितार्थ पर चर्चा करेंगे ।
Protocol
1. फ्लाई कलेक् शन 25 & #176; C, ७०% आर्द्रता पर मानक मक्खी भोजन पर मक्खियों को बनाए रखने, और एक 12 ज/12 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र. एकत्र यूएएस-Dicer2; डीडीसी-GAL4 फ्लाई virginsunder कार्बन डाइऑक्साइड (CO 2 ) संज्ञाहरण. <l…
Representative Results
Discussion
स्वचालित अंगूठी परख यहां वर्णित एक उच्च मक्खियों के एक साथ मक्खी के सैकड़ों के लिए नकारात्मक geotaxis व्यवहार का प्रवाह विश्लेषण सक्षम बनाता है । वयस्क चढ़ाई का विश्लेषण करने के लिए पहले मौजूदा रणनीतियों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम ब्लूमिंगटन स्टॉक सेंटर और उड़ान शेयरों के लिए वियना Drosophila RNAi केंद्र धंयवाद । अंगूठी तंत्र के लिए पेटेंट शंघाई उंनत अनुसंधान संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी के अंतर्गत आता है । RflyDetection सॉफ्टवेयर के लिए अनुरोध फू-डी हुआंग करने के लिए किया जाना चाहिए (लेखक सूची देखें) । यह काम चीन के नेशनल बेसिक रिसर्च प्रोग्राम (९७३ प्रोग्राम 2013CB945602) और नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (३१२७०८२५ और ३११७१०४३) से अनुदान द्वारा समर्थित था । हम चर्चा और टिप्पणियों के लिए हो लैब सदस्यों धंयवाद ।
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
References
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